一种单链抗体及其在检测硫代磷酸酯类农药残留中的应用
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种单链抗体及其在检测硫代磷酸酯类农药残留中的应用。
【背景技术】：
[0002] 硫代磷酸酯类农药属于有机磷农药的一类，其结构上的特点是均有硫代磷酸酯基 骨架。这类化合物多呈油状或结晶状，工业品呈淡黄色至棕色，大多有蒜臭味。一般不溶于 水，易溶于有机溶剂如苯、丙酮、乙醚、三氮甲烷及油类，对光、热、氧均较稳定，遇碱易分解 破坏。
[0003] 硫代磷酸酯类农药具有对害虫高效，防治谱广，作用方式多样，品种繁多，不同品 种间毒性差异较大等特点，而被广泛应用于农业生产和卫生害虫防治领域。伴随着硫代磷 酸酯类农药的广泛使用而带来的农药残留问题也日趋严重。在现实生活中，有机磷农药对 人体的暴露主要来自食品、饮用水和居住环境等，其中食品是残留农药摄入人体的最重要 来源，特别是长期低剂量暴露有机磷农药带来的慢性毒性问题日益受到人们的关注。有机 磷农药主要通过抑制乙酰胆碱酯酶活性发挥其神经毒性作用，长期低剂量接触该类农药会 对人体神经及相关行为产生负面影响。对长期接触毒死蜱的人群研宄发现，人体的神经传 导的速度、对振动的敏感性、视觉、嗅觉、神经行为能力等均与没有接触有机磷农药的人群 有明显的差异，且情绪异常、疲劳等症状较易出现。长期低剂量暴露有机磷农药能够引起中 枢神经系统高级认知功能的损伤，造成自主神经功能障碍、神经精神改变、学习记忆、语言 等认知功能障碍。癌症病变发生与长期接触低剂量有机磷农药也存在一定的相关性。此外， 生殖毒性也是研宄者探宄有机磷农药慢性毒性问题的关注点，大部分有机磷农药对精子的 数量、质量均有不良影响。
[0004] 有机磷农药正逐步向超高效低残留的环保型发展趋势迈进，在农产品和环境中的 残留量也会很低，并且多种农药残留共存，尤其是发达国家对农产品中农药最大残留限量 标准的设立十分严格。这就要求在农产品农药残留检测时，尽量排除待测样品中其他物质 的干扰，采用高灵敏度的检测方法来实现。目前有机磷农药残留检测应用最为广泛的方法 是仪器检测，即色谱技术，如气相色谱（GC)、高效液相色谱（HPLC)，以及在此基础上发展并 得以应用的色谱-质谱联用技术等。这类检测方法具有准确性高，灵敏度好，稳定性高等特 点，但是这类检测方法需要昂贵的实验仪器和专业的技术人员，使用环境也受到限制。相比 传统的仪器检测方法，免疫分析方法被越来越多的应用到农药残留检测领域，其中最具代 表性的方法是酶联免疫分析法（ELISA)，ELISA方法具有快速，灵敏，低成本，适合大样本高 通量检测及实时检测等特点而被广泛应用于有机磷农药残留检测领域。目前国内外开发的 有机磷类农药酶联免疫分析试剂盒中的抗体多采用多克隆抗体或单克隆抗体技术制备，这 种制备方法费用高昂，产量低，极大的限制免疫分析方法的更广泛使用。同时被开发出的试 剂盒多为检测谱单一的，只可特定检测某一种化合物或是农药，无法实现对农药残留分析 的多组分平行检测。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的是提高一种单链抗体及其在检测硫代磷酸酯类农药残留的应用。
[0006] 本发明提供的单链抗体，是由鼠源抗体重链可变区、轻链可变区、连接肽组成的多 肽；所述的重链可变区如序列表的序列1自N末端第1至119位氨基酸序列所示；所述轻链 可变区如序列表的序列1自N末端第135至241位氨基酸序列所示；所述连接肽位于所述 重链可变区与所述轻链可变区之间，所述连接肽如序列表的序列1自N末端第120至134 位氨基酸序列所示。
[0007] 所述单链抗体具体可为序列表的序列1所示的多肽。
[0008] 本发明保护编码所述单链抗体的基因，由所述重链可变区编码序列、所述轻链可 变区编码序列和所述重链可变区的编码序列组成。
[0009] 所述的重链可变区编码序列可如序列表的序列2自5'末端第14至370位核苷酸 所示；所述轻链可变区的编码序列可如序列表的序列2自5'末端第417至736位核苷酸所 示。所述的连接肽编码序列可如序列表的序列2自5'末端第371至416位核苷酸所示。
[0010] 所述基因具体可如序列表的序列2自5'末端第9至736位核苷酸所示的DNA分 子。
[0011] 含有所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒均属于本发明的 保护范围。
[0012] 所述重组载体具体可为将所述编码基因插入pCANTAB5e噬菌粒载体得到的重组 质粒。更具体可为将所述编码基因插入pCANTAB5e噬菌粒载体的SfiI和NotI酶切位点 之间得到的重组质粒。
[0013] 所述重组菌具体可为将所述重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌，更具体可为将 所述重组质粒导入大肠杆菌TG1菌株或大肠杆菌HB2151菌株得到的重组质粒。
[0014] 本发明还保护所述编码基因编码表达的单链抗体，是由重组菌经发酵培养后得到 的单链抗体。
[0015] 本发明还保护所述单链抗体在检测硫代磷酸酯类农药残留中的应用。
[0016] 所述硫代磷酸酯类农药具体可为乙硫磷、乐果、稻丰散、毒死婢、喹硫磷、三唑磷或 二嗪农。
[0017] 本发明基于抗体抗原特异性结合的原理，设计合成硫代磷酸酯类农药通用半抗 原，并将制备的通用人工抗原免疫小鼠，对小鼠的抗体可变区进行定向诱变，并采用重组单 链抗体技术制备抗体，从而获得对硫代磷酸酯类农药特异性结合的单链抗体。本发明采用 重组抗体技术制备单链抗体，并采用噬菌体展示技术对抗体文库进行高效筛选，通过这种 方法制备抗体可以降低成本，并大量制备抗体。
[0018] 本发明提供的单链抗体对多种硫代磷酸酯类农药均有良好的交叉反应率，灵敏度 高，适用于多残留硫代磷酸酯类农药的快速免疫检测。综上，所述发明抗体将在硫代磷酸酯 类农药残留检测中发挥重大作用。
【附图说明】
[0019] 图1为scFv基因构建电泳图；A:轻链编码基因电泳图；B:重链编码基因电泳图； C:scFv全基因电泳图。
[0020] 图2为可溶性抗体表达部位分析图；supernatant为上清液中可溶性抗体组分 ELISA结果；periplasm为包间质中可溶性抗体组分ELISA结果；wholecell为全细胞中可 溶性抗体组分ELISA结果。
[0021] 图3为可溶性抗体SDS-PAGE电泳检测结果图；泳道1为重组菌可溶性蛋白组分电 泳图；泳道2为对照菌可溶性蛋白组分电泳图。
[0022] 图4为可溶性抗体Westernblotting鉴定图；泳道1中scFv所示条带为可溶性 抗体条带。
[0023] 图5为半抗原标准抑制曲线图。
【具体实施方式】
[0024] 下述实施例有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
[0025] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0026] 下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0027] 实施例1、重组单链抗体的制备
[0028] -、硫代磷酸酯类化合物通用半抗原的合成及人工抗原的制备
[0029]1、用10mL去离子水溶解氯乙酸（945mg，lOmmol)，加入等摩尔量的氢氧化钠，得氯 乙酸钠盐水溶液；用5mL去离子水将0, 0-二乙基二硫代磷酸铵盐（1.75g，lOmmol)溶于 50mL圆底反应瓶中，升温至80°C后，逐滴加入氯乙酸钠盐溶液，滴加时间约为30min，磁力 搅拌，约6h后终止反应；待反应液冷却至室温，用等摩尔量的盐酸酸化，二氯甲烷萃取3次， 合并有机相，无水硫酸钠干燥，柱层析得淡黄色油状液体。获得硫代磷酸酯类化合物通用半 抗原，简称H2如式（I)所示。
【主权项】
1. 一种单链抗体，是由鼠源抗体重链可变区、轻链可变区和位于两者之间的连接肽组 成的多肽，所述重链可变区编码序列如序列表的序列2自5'末端第14至370位核苷酸所 示；所述轻链可变区的编码序列如序列表的序列2自5'末端第417至736位核苷酸所示； 所述的连接肽编码序列如序列表的序列2自5'末端第371至416位核苷酸所示。
2. 如权利要求1所述的单链抗体，其特征在于：所述单链抗体为序列表的序列1所示 的多肽。
3. 编码权利要求1所述单链抗体的基因，由所述轻链可变区的编码序列、所述重链可 变区的编码序列和所述连接肽的编码序列组成。
4. 如权利要求3所述的基因，其特征在于：所述的重链可变区编码序列如序列表的序 列2自5'末端第14至370位核苷酸所示；所述轻链可变区的编码序列如序列表的序列2 自5'末端第417至736位核苷酸所示。
5. 如权利要求4所述的连接肽编码序列如序列表的序列2自5'末端第371至416位 核苷酸所示。
6. 如权利要求5所述的基因，其特征在于：所述基因为序列表的序列2自5'末端第9 至736位核苷酸所示的DNA分子。
7. 含有权利要求3至6中任一所述基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
8. -种制备权利要求1或2所述抗体的方法，其特征在于，将权利要求3至6任一所述 的编码基因导入到宿主细胞中，培养，得到的所述抗体。
9. 根据权利要求8所述方法，其特征在于：所述方法中，是通过重组载体将权利要求3 至6所述编码基因导入宿主细胞中的；所述重组载体中既含有权利要求3至6所述重链可 变区的编码基因又含有权利要求3至6所述轻链可变区的编码基因，且所述的重链可变区 编码基因和所述轻链可变区的编码基因在所述重组载体中受同一启动子的调控。
10. 权利要求1或2中任一所述单链抗体在检测硫代磷酸酯类农药残留中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种单链抗体及其在检测硫代磷酸酯类农药残留中的应用。本发明制备的单链抗体，是由鼠源的轻链可变区、重链可变区和位于两者之间的连接肽组成的多肽；该抗体，重链可变区如序列表的序列1自N末端第1至119位氨基酸序列所示；所述轻链可变区如序列表的序列1自N末端第135至241位氨基酸序列所示；所述连接肽位于所述重链可变区与所述轻链可变区之间，所述连接肽如序列表的序列1自N末端第120至134位氨基酸序列所示。实验结果证实，本发明制备的单链抗体对多种硫代磷酸酯类农药具有良好的交叉反应率和高亲和力，适用于多种硫代磷酸酯类农药的快速免疫检测，在农药残留检测领域有广阔的应用前景。
【IPC分类】G01N33-53, C12N15-13, C12N1-19, C07K16-18, C12N15-63, C12N1-21, C12N1-15
【公开号】CN104710531
【申请号】CN201410813915
【发明人】祁志军, 王东方, 刘爽, 寇立泉, 赵吉健, 吴文君
【申请人】杨凌农科大农药研究所
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2014年12月23日