一种盐藻培养方法
【技术领域】
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[0001]本发明属于藻类生物培养技术领域，涉及一种盐藻培养方法，以同时增加盐藻繁殖速度，提高生物量和促进β-胡萝卜素积累，所培养的盐藻可用于医疗保健和卫生防疫技术领域。
【背景技术】
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[0002]盐藻是一种生存在高浓盐湖中的单细胞真核藻类，隶属于绿藻门绿藻纲团藻目盐藻科盐藻属，为绿色单细胞藻，形体微小，无细胞壁，具有糖蛋白形成的包被，是目前发现的唯一能在高浓度盐水中生存的奇特生命，由于富含独特而丰富的生命元素，被世界科学界誉为“细胞的动力源”，“生命的保护剂”，盐藻富含胡萝卜素，可人工培养从中提取甘油或胡萝卜素，还可作鱼、虾、贝等幼体的饵料；在医疗卫生领域可预防和辅助治疗冠心病、心脑血管疾病、糖尿病、癌症、肝脏疾病、胃部常见病、口腔溃疡、白内障、干眼症，减轻化疗不良反应、改善视力、提高免疫力、抗氧化、延缓衰老；由于盐藻无细胞壁，添加到动物饲料中，可促进饲料转化率提高动物的生长速度，减少疾病，开发“绿色饲料”对提高动物饲料产品质量具有重大意义；盐藻巨大的经济价值和独特的优点已使其成为大规模培养的对象，很多国家和地区都在培养和开发盐藻，包括澳大利亚、日本、以色列、美国等，我国的海南和内蒙古也进行了盐藻的培养，目前的培养方法采用低强度光照和温度，适合盐藻生物量的快速生长，但是不利于胡萝卜素的累积，而且营养元素相对缺乏，特别是氮元素，降低了营养价值；采用高强度光照和温度，有利于胡萝卜素的积累，但是严重影响了盐藻的生长繁殖量。因此研发既能增加盐藻繁殖速度，提高生物量，又能促进胡萝卜素积累的培养方法很有应用前景和社会价值。
【发明内容】
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[0003]本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计一种既能增加盐藻繁殖速度，提高生物量，又能促进胡萝卜素积累的工艺方法，可应用于医疗保健、卫生防疫、动物饲料领域。
[0004]为了实现上述目的，本发明涉及的盐藻培养方法包括盐藻繁殖和β -胡萝卜素积累两个步骤:
[0005](I)盐藻繁殖:先在盐藻培育反应器内安置光源，调整光照强度为2000— 4000LX，温度为25— 28°C，盐藻培养剂中的盐的重量百分比浓度为I一 1.2%，氮源(KNO3)为I—1.5mL，磷源(KH2PO4)为0.3mL，无机碳源(NaHCO4)为10 — 15mL，在盐藻培养剂中接种盐藻，盐藻培育分别经过I一2天的生长期、I一2天的对数生长期和I一2天的平台期后分别测量盐藻培养剂中氮源(KNO3)、磷源(KH2PO4)和无机碳源(NaHCO4),使其分别达到0.5mL、0.1mL和1mL以下时，进行盐藻生物量测定，使其达到最高值，完成盐藻繁殖；
[0006](2) β-胡萝卜素积累:再将盐藻培育反应器内所安置的光源调节光照强度为7000— 9000Lx，温度为31—35 °C ;向盐藻培养剂中分别添加食盐、KNO3^KH2PO4、NaHCO4,使得盐的重量百分比浓度为3.2—3.5%，氮源(KNO3)为0.5mL，磷源(KH2PO4)为0.lmL，无机碳源(NaHCO4)为10mL，再经3—5天培养后盐藻由深绿色逐渐变成褐色，实现β-胡萝卜素的积累，然后测定其胡萝卜素达到预期值，完成盐藻的培养。
[0007]本发明涉及的盐藻生物量测定工艺方法是:取ImL盐藻繁殖阶段的盐藻培养剂，用0.1mL无水酒精麻醉后滴入血球计数板测量得ImL中微藻绝对值，同时用分光光度计在吸光度A700nm时测定微藻绝对值对应的光密度(OD值)，分别测量5次得5个微藻绝对值和光密度(OD值)，并按照微藻绝对值和光密度(OD值)对应关系绘制盐藻生物量标准曲线，以后只需测定盐藻光密度(OD值)即可对应得出盐藻生物量，实现盐藻生物量的测定。
[0008]本发明涉及的胡萝卜素测定工艺方法是:取5mLf3_胡萝卜素积累阶段的盐藻培养剂，加入一滴重量百分比浓度为20%的氢氧化钠(NaOH)混匀后以3000r/min的速度离心3分钟，弃上清液；再加入一滴重量百分比浓度为80%的丙酮(C3H6O)水溶液摇匀后离心I分钟，提取色素，反复提取至盐藻培养剂为无色，合并含丙酮(C3H6O)提取液定容为25mL混合液，用分光光度计在吸光度A450nm时测定混合液光密度(0D值)，然后依据盐藻生物量测定的对应关系推得盐藻中胡萝卜素的值。
[0009]本发明与现有技术相比，将盐藻的培养工艺分为两个阶段，第一阶段主要是增加盐藻的繁殖速度，提高生物量，第二阶段主要是加大协迫因素，促进胡萝卜素的积累，其培养工艺科学合理，步骤简单，性能稳定，不受外界环境影响，产品利用率高。
【具体实施方式】
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[0010]下面通过实施例对本发明作进一步描述。
[0011]实施例1:
[0012]本实施例涉及的盐藻培养过程包括盐藻繁殖和β -胡萝卜素积累两个步骤:
[0013](I)盐藻繁殖:先在盐藻培育反应器内安置光源，调整光照强度为2000— 4000LX，温度为25— 28°C，盐藻培养剂中的盐的重量百分比浓度为I一 1.2%，氮源(KNO3)为I—1.5mL，磷源(KH2PO4)为0.3mL，无机碳源(NaHCO4)为10 — 15mL，在盐藻培养剂中接种盐藻，盐藻培育分别经国I一2天的生长期、I一2天的对数生长期和I一2天的平台期后分别测量盐藻培养剂中氮源(KNO3)、磷源(KH2PO4)和无机碳源(NaHCO4)使其分别达到0.5mL、0.1mL和1mL以下时，进行盐藻生物量测定，使其达到最高值，完成盐藻繁殖；
[0014](2) β-胡萝卜素积累:再将盐藻培育反应器内所安置的光源调节光照强度为7000—9000Lx，温度为31—35°C，用添加食盐、KN03、KH2P04、NaHC04的方法调整盐藻培养剂，使盐的含量重量百分比浓度为3.2—3.5%，氮源(KNO3)为0.5mL，磷源(KH2PO4)为0.1mL,无机碳源(NaHCO4)为10mL，再经3—5天培养后盐藻由深绿色逐渐变成褐色，实现β-胡萝卜素的积累，然后测定其胡萝卜素达到预期值，完成盐藻的培养。
[0015]本实施例涉及的盐藻生物量测定工艺方法是:取ImL盐藻繁殖阶段的盐藻培养剂，用0.1mL无水酒精麻醉后滴入血球计数板测量得ImL中微藻绝对值，同时用分光光度计在吸光度A700nm时测定微藻绝对值对应的光密度(0D值)，分别测量5次得5个微藻绝对值和光密度(0D值)，并按照微藻绝对值和光密度(0D值)对应关系绘制盐藻生物量标准曲线，以后只需测定盐藻光密度(0D值)即可对应得出盐藻生物量，实现盐藻生物量的测定。
[0016]本实施例涉及的胡萝卜素测定工艺方法是:取5mLf3_胡萝卜素积累阶段的盐藻培养剂，加入一滴重量百分比浓度为20%的氢氧化钠(NaOH)混匀后以3000r/min的速度离心3分钟，弃上清液；再加入一滴重量百分比浓度为80%的丙酮(C3H6O)水溶液摇匀后离心I分钟，提取色素，反复提取至盐藻培养剂为无色，合并含丙酮(C3H6O)提取液定容为25mL混合液，用分光光度计在吸光度A450nm时测定混合液光密度(0D值)，然后依据盐藻生物量测定的对应关系推得盐藻中胡萝卜素的值。
[0017]实施例2:
[0018]本实施例涉及的盐藻培养方法过程为:
[0019](I)盐藻藻种培育:从中国水科院黄海水产研宄所藻种库引进杜氏盐藻藻种，经三级扩种后，进行产业化培育；
[0020](2)盐藻繁殖:将盐藻培育反应器内安置的光源调整其光照强度为3000LX，温度为28 °C，培养剂包括氯化钠(NaCl) 1g,氮源(KNO3) ImL,磷源(KH2PO4) 0.1mL,无机碳源(NaHCO4) 10mL，麦饭石导出液50mL，水(H2O) 100mL，在盐藻培养剂中接种重量占培养剂20%的藻种，藻种培育5天经生长期、对数生长期和平台期后用分光光度计测量盐藻光密度(0D值)，对应出盐藻生物量，测量培养剂氮源(KNO3)低于0.3mL时，完成盐藻繁殖；
[0021](3) β-胡萝卜素积累:将盐藻培育反应器内安置的光源调整其光照强度为8000Lx，温度为35°C，在培养剂中添加氯化钠(NaCl)使其中盐的重量百分比浓度达到3.2%，进行协迫培养3-5天，盐藻变成黄褐色时，测定盐藻中β-胡萝卜素的含量，完成
胡萝卜素积累，实现盐藻的培养；
[0022](4)采收、干燥:采收盐藻并喷雾干燥成藻粉，包装成袋。
[0023]本实施例涉及的盐藻生物量测定和β -胡萝卜素测定按照实施例1的步骤和方法进行。
【主权项】
1.一种盐藻培养方法，其特征在于具体包括盐藻繁殖和β -胡萝卜素积累两个步骤: (1)盐藻繁殖:先在盐藻培育反应器内安置光源，调整光照强度为2000—4000LX，温度为25— 28°C，盐藻培养剂中的盐的重量百分比浓度为I一 1.2%，氮源为I一 1.5mL，磷源为0.3mL，无机碳源为10 — 15mL，在盐藻培养剂中接种盐藻，盐藻培育分别经国I一2天的生长期、I一2天的对数生长期和I一2天的平台期后分别测量盐藻培养剂中氮源、磷源和无机碳源使其分别达到0.5mL、0.1mL和1mL以下时，进行盐藻生物量测定，使其达到最高值，完成盐藻繁殖； (2)β-胡萝卜素积累:再将盐藻培育反应器内所安置的光源调节光照强度为7000—9000Lx，温度为31—35°C，用添加食盐、KN03、KH2PO4, NaHCOj^]方法调整盐藻培养剂，使盐的含量重量百分比浓度为3.2—3.5%，氮源为0.5mL，磷源为0.lmL，无机碳源为10mL，再经3— 5天培养后盐藻由深绿色逐渐变成褐色，实现β-胡萝卜素的积累，然后测定其胡萝卜素达到预期值，完成盐藻的培养。
2.根据权利要求1所述的盐藻培养方法，其特征在于盐藻生物量测定工艺方法是:取ImL盐藻繁殖阶段的盐藻培养剂，用0.1mL无水酒精麻醉后滴入血球计数板测量得ImL中微藻绝对值，同时用分光光度计在吸光度A700nm时测定微藻绝对值对应的光密度，分别测量5次得5个微藻绝对值和光密度，并按照微藻绝对值和光密度对应关系绘制盐藻生物量标准曲线，以后只需测定盐藻光密度即可对应得出盐藻生物量，实现盐藻生物量的测定。
3.根据权利要求1所述的盐藻培养方法，其特征在于β-胡萝卜素测定工艺方法是:取5mLf3 -胡萝卜素积累阶段的盐藻培养剂，加入一滴重量百分比浓度为20%的氢氧化钠混匀后以3000r/min的速度离心3分钟，弃上清液；再加入一滴重量百分比浓度为80%的丙酮水溶液摇匀后离心I分钟，提取色素，反复提取至盐藻培养剂为无色，合并含丙酮提取液定容为25mL混合液，用分光光度计在吸光度A450nm时测定混合液光密度，然后依据盐藻生物量测定的对应关系推得盐藻中胡萝卜素的值。
【专利摘要】本发明属于藻类生物培养技术领域，涉及一种盐藻培养方法，先将盐藻培育反应器内的光照强度和温度调整至适宜盐藻繁殖，在包含盐、氮源(KNO3)、磷源(KH2PO4)、无机碳源(NaHCO4)的盐藻培养剂中接种盐藻，盐藻培育经生长期、对数生长期和平台期后分别测量盐藻培养剂中氮源、磷源和无机碳源，使其分别达到设定值，进行盐藻生物量测定，完成盐藻繁殖；调整光照强度和温度至适宜β-胡萝卜素积累，向盐藻培养剂中分别添加食盐、KNO3、KH2PO4、NaHCO4，使其达到设定值，经过培养盐藻变成褐色时，实现β-胡萝卜素的积累，完成盐藻的培养；其培养工艺科学合理，步骤简单，性能稳定，不受外界环境影响，产品利用率高。
【IPC分类】C12R1-89, C12N1-12
【公开号】CN104711195
【申请号】CN201510152906
【发明人】丁河峰, 吴洪星, 徐权汉
【申请人】丁河峰
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年4月2日