水稻缺氮后恢复供氮特异诱导表达的启动子y8a及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种水稻缺氮后恢复供氮特异诱导 表达的启动子Y8A及应用
【背景技术】
[0002] 目前转基因研究主要以组成型启动子驱动目的基因表达，最典型的是花椰菜花叶 病毒中分离的CaMV35S启动子（Hirt et al.，1990;Battraw et al.，1990)，以及近年来一 些植物来源的启动子，如从水稻中克隆的肌动蛋白基因Actinl的启动子和玉米中克隆的 泛素基因ubiquitin启动子（Schledzewski et al.，1994)。但是外源基因的组成型表达往 往会造成资源的非必要浪费，同时大量异源蛋白的积累也会打破植物原有的代谢平衡，阻 碍植物的正常生长(聂丽娜等，2008;Rai et al.，2009)。Kasuga等（1999)在研究中发现， 使用强的组成型表达启动子CaMV35S启动DREB1A的表达时，对植物的生长可能起到某种程 度的阻碍作用，而用诱导型的启动子可以减轻这种状况。诱导型的启动子可以快速有效地 诱导转录基因的"开、关":可根据需要在植物特定发育阶段、组织器官或生长环境下接受诱 导信号，诱导基因表达，也可以随时解除胁迫，停止表达(李杰等，2006)。因此，获得水稻在 氮饥饿状态下诱导表达的启动子，不仅可以减少外源基因大量表达带来的负面影响，更能 为基因工程改良水稻提供安全有效的调控。
[0003] 在植物生长所需的各种大量元素中，氮素是限制植物生长和形成植物产量的首要 因素。氮不仅是遗传物质的基础，更是蛋白质、核酸、叶绿素、酶、维生素、生物碱和植物激素 等的重要组成部分(陆景陵，1994)。近半个世纪以来，世界各国都把增施氮肥作为增加水稻 产量的重要农业措施，特别是第一次绿色革命之后，随着高产耐肥品种推广应用，农田氮肥 施用量迅猛增长，极大提高了水稻的产量（钟代斌等，2001)。农田氮肥的过量施用，随之而 来的便是氮素利用率降低以及一系列的环境问题。氮素的大量流失直接导致地下水污染和 江河湖泊的富营养化作用（王光火等，2003)。
[0004] 随着分子生物学和基因工程在植物领域的迅速发展，植物对氮吸收转运的分子 机制也越来越清晰。大量的铵盐转运子、硝酸盐转运子被发现，GS/G0GAT(谷氨酸胺合成 酶/谷氨酸合成酶）循环同化铵机理被揭示，为基因工程改良水稻氮的吸收利用提供大量 的研究素材。虽然通过突变体或者吸收实验等验证了不少基因的吸收转运功能，但是这些 基因在水稻体内的超量表达并未达到提高吸收转运铵的目的。Mohammad等（2006)用玉米 ubiquitin启动子超量表达水稻中的铵盐转运子OsAMTl-1，提高了水稻中铵的吸收能力以 及根中总铵含量，但同时产生了铵的毒害，导致地上部生物量大量减少。如果改为缺氮诱导 启动子驱动，就有可能根据植株的需要，适当控制铵的吸收，避免毒害。GS是参与NH4+同化 合成谷氨酰胺（Gin)的主要酶，Cai等（2009)用35S启动子在水稻品种中花11中超量表达 水稻谷氨酰胺合成酶基因GS1; 1、GS1; 2和大肠杆菌谷氨酰胺合成酶基因glnA，GS活性、总 氮含量、氨基酸含量、可溶性蛋白等都得到了显著提高，但是单株生物学产量及籽粒产量都 显著下降了。如果改为供氮诱导启动子驱动，不仅可以降低组成型表达造成的"浪费"，更 可以保证仅在供氮充足的情况下促进GS的同化，避免单株因氮源不足而造成生物学产量 降低。
[0005] 本发明通过芯片发掘了一个供氮诱导基因表达的启动子，用实时定量realtime PCR在三个不同品种中进行了验证，同时通过水稻稳定转化进一步确定了该启动子是一个 供氮诱导的启动子，为基因工程改良水稻对氮的吸收利用提供了新的材料。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有的技术缺陷，提供了一种在水稻缺氮后恢复供氮特异 性诱导表达的启动子及应用。该启动子为Y8A及其截断的片段Y8B，所述的启动子在水稻 中供氮诱导基因表达的用途如下：芯片结果显示，日本晴和珍汕97在缺氮胁迫7d后再供氮 时，启动子Y8A控制的下游基因在根中均诱导表达20倍左右，而在地上部组织中不诱导表 达。在其它四个常规水稻品种：中花11、华粳295、9311、]?册3中，通过代 &1^1116?0?验证 (RealtimePCR的方法参见TAKARA商业试剂盒的使用说明书，货号：code:DRR041A)发现 启动子Y8A控制的下游基因在缺氮7d后再恢复供氮2h时亦可诱导表达20倍以上。从中 花11 (或称ZH11)材料中扩增启动子Y8A全长序列融合GUS基因稳定转化水稻，并构建系 列5'端缺失载体，将转基因阳性材料进行缺氮胁迫后供氮处理，发现供氮前后GUS基因在 根中表达量显著诱导表达。进一步验证了启动子Y8A供氮诱导表达的特性，并且功能区段 在ATG上游982bp内。
[0007] 本发明是这样实现的：
[0008] 本发明以水稻品种日本晴(英文名称：Nipponbare，一个公知公用的水稻品种材 料，且已经完成全基因组测序的水稻品种）和珍汕97 (-个公知公用的水稻品种，来自江西 省农业科学院）作为基础材料，水培幼苗至5叶期，分不同时间点缺氮胁迫处理取样(缺氮 lh、缺氮Id、缺氮3d、缺氮7d、缺氮7d后恢复供氮2h、恢复供氮ld)，以持续正常植物栽培 营养液(为常规报道的植物栽培营养液)培养的幼苗作为对照，利用全基因组cDNA芯片表达 谱作为技术手段(杨蓉等，1999)，得到了一个在两种材料的根中供氮2h后都高倍诱导表达 的基因，根据这些基因的信息在NCBI网站（www.ncbi.nlm.nih.gov)获得了基因上游序列 即其启动子序列，同时，申请人按同样的处理方法处理了其它四个常规品种：中花11、华粳 295、9311、MH63,并通过realtimePCR验证了该基因供氮诱导的表达模式。将启动子序列 融合GUS报告基因构建到启动子载体DX2181b(载体DX2181b是申请人所在作物遗传国家 重点实验室研究人员在商业载体PCAMBIA1381，一个来自澳大利亚公开报道和使用的质粒 的基础上改造得到的，见图2)上，再进行农杆菌介导的遗传转化，转化水稻品种中花11，得 到阳性转化植株。检测转化阳性植株的GUS基因表达量发现，缺氮处理7d后供氮2h的GUS 基因的表达量显著上升。
[0009] 本发明的优点在于：
[0010] (1)本发明提供了一种在水稻中供氮诱导基因表达启动子的应用。在六个不同的 品种中验证了该启动子下游基因的表达量缺氮处理后恢复供氮高倍诱导的表达模式。启动 子融合⑶S基因稳定转化水稻阳性植株中，⑶S表达量供氮处理后均显著上升。
[0011] (2)本发明首次发现了启动子Y8A是一个在水稻各品种中广泛供氮高倍诱导基因 表达的启动子，并且功能区段在ATG上游982bp内，为基因工程改良水稻中如何有效控制氮 素的吸收同化提供了新的材料。
[0012] (3)本发明中应用的启动子及其下游基因可以为水稻等禾谷类作物以及其它作物 的营养代谢研究提供支持。
【附图说明】
[0013]SEQIDN0 :1是启动子Y8A的核苷酸序列，序列全长为1936bp。
[0014]SEQIDNO:2是启动子Y8A的其中一个截短的启动子区段Y8B的核苷酸序列，序 列全长为982bp。
[0015]SEQIDNO:3是启动子Y8A的CDS区序列，序列全长为414bp，编码137个氨基酸。
[0016]SEQID N0 :4是启动子Y8A的蛋白质的序列。
[0017] 图1.是本发明的总体技术路线图。
[0018] 图2.是载体DX2181b的结构示意图。图2a是DX2181b改造前载体pCAMBIA1381 载体结构图；图2b是载体DX2181b的结构示意图；图2c是载体DX2181b的多克隆位点结 构。
[0019] 图3.是启动子融合GUS表达载体稳定转化水稻片段的结构示意图。其中：图3a 为Y8A融合GUS表达载体的构建示意图；图3b为Y8B融合GUS表达载体的构建示意图。
[0020] 图4.启动子Y8A下游基因在芯片材料中的表达模式。图4中a是芯片数据，显示 在日本晴（nip)和珍汕97 (ZS)两个品种的芯片数据中该基因供氮强烈诱导；图4中b是 以芯片同批珍汕97材料重新抽提RNA做realti