一种鱼精蛋白专用编码基因及其应用
【专利说明】一种鱼精蛋白专用编码基因及其应用 【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及一种鱼精蛋白专用编码基因及其利用该 编码基因制备鱼精蛋白的方法。 【【背景技术】】
[0002] 鲑鱼又称三文鱼，是深海鱼类的一种，为常用的食品之一，中国产的大马哈鱼便是 鲑鱼的一种。鲑鱼在淡水环境下出生，之后移到海水生长，又会回到淡水繁殖。成熟雄鱼的 精巢组织称鱼精，因具有异味，多被废弃或作废料。但鱼精中含有鱼精蛋白（Protamine)，鱼 精蛋白也称精蛋白，是一种碱性蛋白质，主要存在于鱼类（鲑鱼、鲱鱼、鳟鱼）的成熟精子细 胞中，与DNA紧密结合在一起，以所谓的核精蛋白的形式存在。
[0003] 鱼精蛋白相对分子量小，一般由30~50个氨基酸组成，分子中2/3以上的氨 基酸都是精氨酸，等电点在pH10~12,可溶于水和烯酸，加热不凝固。根据碱性氨基酸 组成的种类和数量不同，可将鱼精蛋白分为单鱼精蛋白（monoprotamine)，双鱼精蛋白 (diprotamine)和三鱼精蛋白（triprotamine)3种。其中，单鱼精蛋白仅含一种组分精氨 酸，如鲑、鲱和虹鳟精蛋白等；双鱼精蛋白含有精氨酸、组氨酸或赖氨酸，如鲤精蛋白；三鱼 精蛋白含有3种碱性氨基酸，如鲢、舞精蛋白。研宄表明常见鱼精蛋白并不是单一组分，它 们通常是由几种成分组成的混合物，如鲱鱼精蛋白经离子交换层析后分离出3种成分，且 成分之间彼此非常相似，而红鳟鱼精蛋白则由6种差别极小的成分组成。不同鱼种鱼精蛋 白在氨基酸组成比例上有很大的差别，但是它们存在很多相似的特征。Yoshiko研宄了 12 种鱼类的鱼精蛋白结构，发现12种鱼精蛋白的N-末端均为精氨酸或丙氨酸，且均含有4个 较长的和2个较短的精氨酸簇，分别被Thr或Ser、Gly-Gly、Pro-lie或Val-Val特征性残 基分隔开。
[0004] 在动物精细胞中还存在着一种与鱼精蛋白结构非常相似的蛋白质一组蛋白，组蛋 白也是一种碱性蛋白质，与细胞中DNA结合起着维持DNA结构稳定的作用，其分子结构比鱼 精蛋白复杂，通常由H1、H2A、H2B、H3、H4五种组分组成。在精子细胞成熟阶段，鱼精蛋白逐 步代替组蛋白而与DNA结合使DNA处于稳定且不转录的状态。国外学者的研宄表明鱼精蛋 白的形成经历了组蛋白-中间蛋白-精蛋白的转化过程，在此过程中，中间蛋白可能存在 TP1和TP2两种结构异构体，因而可以解释鱼精蛋白含有两种或多种组分；同时，还发现不 同成熟度和成熟阶段的鱼类精巢中精蛋白成分和含量的不同，完全成熟的鱼类精巢更适合 于提取鱼精蛋白，而不成熟或未完全成熟的鱼精蛋白中杂蛋白较多，这些杂蛋白或许是不 成熟的鱼精中未完全转变成鱼精蛋白的组蛋白或中间蛋白。因此，提取鱼精蛋白时考虑鱼 的性成熟程度是很有必要的。
[0005] 自1937年McClean等报道了鱼精蛋白能够抑制伤寒埃氏杆菌的生长、Miller等 发现鱼精蛋白能够抑制多种好氧菌和厌氧菌的呼吸代谢从而影响其成长繁殖之后，鱼精蛋 白的抑菌作用才受到人们的广泛关注，作为化学防腐剂的替代品逐渐出现在食品添加剂行 列。
[0006] 鱼精蛋白的一个重要特点就是具有良好的抑菌活性，它能明显的抑制革兰氏阳性 (G+)、霉菌、酵母的生长，对巨大芽孢杆菌、枯草杆菌等也有一定抑制作用。起初研宄人员认 为，鱼精蛋白只对革兰氏阳性菌抑制作用明显，对革兰氏阴性菌（G-)、霉菌及酵母几乎没有 抑制作用，但后来研宄的结论表明并非如此，认为鱼精蛋白的抑菌性与革兰氏反应没有直 接关系。也有研宄表明鲑精蛋白对G+和G-均具有明显抑制作用并且对霉菌和酵母抑制作 用更强。鱼精蛋白对不同微生物的最低抑菌浓度因菌种的不同有较大差异，比如虽然鱼精 蛋白具有较强的抗霉菌作用，但对Walemiasebi、Aspergillus等几乎没有作用。
[0007] 鱼精蛋白能够抑制微生物的生长，这引起人们对其抑菌机理的探讨。国内外学 者针对于此做了大量研宄，目前存在的理论主要有：一是鱼精蛋白作用于微生物的细胞壁 和质膜系统；二是该蛋白作用于细胞内酶系统或功能蛋白；三是鱼精蛋白作用于遗传物 质。Antohi等通过研宄提出了鱼精蛋白作用于微生物细胞壁而起抑菌作用这一假设性论 断；Arden等认为鱼精蛋白通过影响细胞质膜的功能而具有抑菌效果；Kashket和Berger 等人的研宄结果表明鱼精蛋白通过影响微生物细胞质膜而影响微生物对脯氨酸的吸收； Mishihara的研宄发现鱼精蛋白可以抑制细菌细胞中葡萄糖和氧气的消耗，认为鱼精蛋白 可能是吸附在微生物细胞的表面并破坏细菌细胞质膜引起的；也有观点认为鱼精蛋白抗菌 效果是通过对这2个部位（细胞壁和细胞质膜）共同作用而产生的叠加效果；鱼精蛋白还 可以使细胞丧失积累亮氨酸的能力，阻断细胞内蛋白质的合成，直至破坏能量传导和营养 的摄取，还可降低ATP合成，损害细胞内质子电动势的产生能力，从而抑制细胞的新陈代谢 能力；也有研宄表明在半致死浓度时鱼精蛋白还可抑制基因转录。由此可见，对于鱼精蛋白 的抑菌机理，国内外学者开展了大量深入的研宄，观点不一，抑菌机理宄竟怎样还有待于进 一步探索和研宄。
[0008] 由于鱼精蛋白在抑菌防腐方面以及安全性、稳定性和营养性等方面都具有众多的 优势，鱼精蛋白代替化学防腐剂使用在食品行列有着广阔的前景。此外，鱼精蛋白主要可用 于因注射肝素过量所引起的出血，且无其他药品可替代，抑制肿瘤生长繁殖，增强肝功能， 促进细胞繁殖发育。
[0009] 因为利润低以及鱼精蛋白本身的不可替代性，而且鉴于鱼精蛋白的原料有季节 性，原料受自然制约性很强，导致出现供货紧张的情况。自2011年开始，南京、武汉、南通等 地鱼精蛋白纷纷告急，很多心脏病手术被迫停止。由于鱼精蛋白完全是天然成分，具有很高 的安全性，具有安全、无毒、无副作用的优点，作为一种新型防腐剂，在食品工业中具有广阔 的应用前景。我国鱼资源丰富，充分开发鱼白资源，变废为宝，有一定的经济效益和社会效 益，但是直接提取产量有限。 【
【发明内容】
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[0010] 本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种鱼精蛋白专用编码基因。
[0011] 本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种利用上述编码基因制备鱼精蛋白 的方法。
[0012] 本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题之一的：一种鱼精蛋白专用编码基 因，该编码基因的碱基序列如SEQIDNO: 1所示。
[0013] 本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题之二的：一种利用上述编码基因制 备鱼精蛋白的方法，其包括如下具体操作：
[0014] (1)将权利要求1所述编码基因与载体pET22b连接后转化入BL21感受态，获得工 程菌BL21-pET22b-CYGB-Pro;
[0015] (2)挑取工程菌BL21-pET22b-CYGB-Pro单菌落并接种入含Ampl00yg/ml的LB培 养基中培养16h，之后按1:100的体积比转入含AmplOOyg/ml的乳糖诱导培养基中，诱导培 养20h，接着于4°C、6000rpm条件下离心20min，然后收集菌体，并置于-80°C下保存；
[0016] (3)将步骤（2)收集到的菌体经-80°c和4°C反复冻融三次裂解菌体，加入破菌液， 且每1克菌体加入10毫升破菌液，并于4°C，10000rpm下离心20min，离心结束后分别收 集沉淀和上清液，融合蛋白CYGB-Pro大部分位于沉淀中；接着采用沉淀洗涤液洗涤沉淀两 次，之后用沉淀溶解液溶解洗涤后的沉淀，得溶解液；将溶解液经NiSepharose亲和层析 进行纯化洗脱，所用洗脱液的组分为0.5MNaCl、20mMNaH2P04、500mMImidazole、8MUrea、 pH= 7. 4,最终洗脱液中的蛋白即为纯化后的融合蛋白CYGB-Pro;
[0017] (4)将步骤（3)所得纯化后的融合蛋白CYGB-Pro进行CNBr裂解，具体地：将纯化 后的融合蛋白CYGB-Pro,置于通风橱中，并于通风橱中加入浓度为0. 2M的浓盐酸终、终浓 度为50mg/ml的CNBr，避光室温裂解24h，之后加入等体积的ddH20灭活CNBr;然后采用流 速为3mL/min的G-25分子筛进行脱盐纯化，即得所述鱼精蛋白，且脱盐纯化采用的平衡液 和洗脱液均为去离子水。
[0018]进一步地，所述破菌液的组分：0?5MNaCl，2