一种绿盲蝽卵黄原蛋白、其特异性肽链、载体、菌株及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业科学技术领域，具体涉及一种绿盲蝽卵黄原蛋白、其特异性肽链、 载体、菌株及应用。
【背景技术】
[0002] 昆虫卵黄原蛋白（Vg蛋白）是存在于昆虫雌成虫体液中的一种重要蛋白，是昆虫 卵黄蛋白的前体，对于昆虫卵的发育具有重要作用，其在雌性昆虫体内的含量高低决定雌 成虫产卵潜力大小。绿盲蝽Apolyguslucorum(Hemiptera:Miridae)属半翅目盲蝽科，是 我国目前包括Bt棉在内的多种经济作物上的主要害虫。由于绿盲蝽具有多食性、移动快、 取食隐蔽等特点，导致目前农业生产上对于绿盲蝽种群数量精确测报技术的研发面临严峻 挑战。而对绿盲蝽产卵量的准确测报是其田间种群测报过程中重要一环，并对其防治具 有重要的指导意义，因此急待开拓绿盲蝽种群测报的新技术。运用Vg含量开发害虫种群 测报工作是一种绿盲蝽种群测报的新兴方法，然而对于编码绿盲蝽卵黄原蛋白（Apolygus lucorumVitellogenein，AlVg)蛋白表达量的检测方法相对匮乏，同时针对AlVg基因、蛋 白相对表达量与其产卵量的关系，国内外尚未见相关报道。因此分离纯化AlVg基因特异性 肽链的氨基酸序列，制备其抗体，研宄其AlVg基因、蛋白相对表达量与其产卵量的相关性， 这对于利用AlVg基因、蛋白相对表达量进一步开发绿盲蝽种群测报新技术有着重要的理 论意义和指导作用。
【发明内容】
[0003] 发明目的：本发明的第一个目的是提供一种用于编码绿盲蝽卵黄原蛋白的DNA序 列，其喊基序列如SEQ ID NO :1所不。
[0004] 本发明的另一个目的在于提供一种绿盲蝽卵黄原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO : 2所示。
[0005] 本发明的又一个目的是提供一种用于编码绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的DNA 序列，其碱基序列如SEQ ID NO :3所示。
[0006] 本发明的又一个目的是提供一种绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链，其氨基酸序列如 SEQ ID NO :4所示。
[0007] 本发明的又一个目的是提供含有所述的用于编码绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链 的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。
[0008] 本发明的又一个目的是提供一种转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达 载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。
[0009] 本发明的又一目的是提供一种绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的制备方法。
[0010] 技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供一种用于编码绿盲蝽卵 黄原蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO :1所示。
[0011] -种绿盲蝽卵黄原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0012] -种用于编码绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的DNA序列，其碱基序列如SEQID NO: 3所示。
[0013] -种绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链，其氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。
[0014] 含有所述的用于编码绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的DNA序列的重组表达载体、 转基因细胞系统或转基因重组菌。
[0015] 将所述的DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达绿盲蝽卵黄原蛋白特 异性肽链的重组表达载体。
[0016] 其中，上述大肠杆菌表达载体为pCznl。
[0017] -种转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选 得到转基因重组菌。
[0018] 本发明所述的大肠杆菌为BL21 (DE3)。
[0019] 本发明所述的AlVg蛋白的特异性肽链DNA序列、所述的重组表达载体、转基因细 胞系统或转基因重组菌在生产AlVg蛋白特异性肽链抗体中的应用。
[0020] 一种AlVg蛋白特异性肽链的制备方法，是培养所述的转基因重组菌得到的AlVg 蛋白特异性肽链。
[0021] 一种AlVg蛋白特异性肽链抗体的制备方法，是经过抗原亲和纯化法获得针对 AlVg蛋白特异性肽链多克隆抗体。
[0022] 一种AlVg蛋白特异性肽链的制备方法，包括以下步骤：
[0023] 1)、绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链cDNA片段的PCR扩增，所述绿盲蝽卵黄原蛋白 特异性肽链cDNA序列如SEQIDNO:3所示；
[0024] 2)、绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链cDNA片段的原核表达载体构建；
[0025]3)、绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的变性和复性；
[0026] 4)、绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的纯化即得。
[0027] 然后将上述得到的AlVg蛋白特异性肽链采用抗原亲和纯化法获得针对AlVg蛋白 特异性肽链多克隆抗体；
[0028] 最后Western杂交验证AlVg蛋白特异性肽链抗体的效果，并分析绿盲蝽取食不同 寄主植物后，雌成虫AlVg蛋白表达量差异。
[0029] 有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：
[0030] 1.本发明的AlVg蛋白由1991个氨基酸组成，在昆虫体内是相对比较大的蛋白，很 难全长表达，进而合成特异性抗体较难。因此本发明在获得AlVg蛋白cDNA全长的基础上， 经过国际权威基因数据库NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)分析 后，分析获得AlVg蛋白258个氨基酸的特异性肽链序列，利用此序列制作的抗体可以用于 AlVg蛋白的相对表达量检测。纯化出的AlVg蛋白特异性肽链抗体不同田间寄主采集AlVg 蛋白含量比较，同时可为绿盲蝽田间种群测报新技术的研发提供基础。
[0031] 2.本发明的AlVg蛋白在其雌成虫羽化后1-7天其表达量逐渐升高，并在雌成虫羽 化后7天达到峰值，并且其表达量在绿盲蝽取食不同寄主过程中与绿盲蝽单雌产卵量存在 显著相关性（P〈〇. 01)。由于绿盲蝽在田间存在严重的世代重叠现象，因此可以采集绿盲蝽 雌成虫，分析其AlVg蛋白含量的方式与室内数据对比预测绿盲蝽田间爆发潜力。
【附图说明】
[0032] 图1 :AlVg基因开放阅读框PCR扩增电泳图；泳道1:为lOOOObp的DNA maker;泳 道2 :AlVg基因；
[0033] 图2 :AlVg蛋白氨基酸序列特征示意图；AlVg氨基酸序列特征区域分析，其中氨基 酸序列数字编码在图的右侧，AlVg氨基酸序列在NCBI保守区预测后呈现三个保守区域，即 1)两个vitellogenin-N结构域（黑框部分）；2)DUF1943结构域（黑色加粗的下划线）；c) von Willebrand factor(VWF)结构域（氨基酸英文字体加深部分）；此外，保守的连续氨基 酸序列RXXR，DGXR及GL/ICG以加粗的双下划线呈现在图中；前17个氨基酸序列为信号肽 序列，并以向下的加粗箭头标注；*表示为终止氨基酸；
[0034] 图3 :AlVg蛋白特异性肽链DNA序列的PCR扩增电泳图；泳道1:为2000bp的DNA maker;泳道2 :AlVg蛋白特异性肽链DNA序列；
[0035] 图4AlVg特异性肽链cDNA序列连接pCznl表达载体后Ndel和Xbal双酶切图谱； 泳道1 :为l〇〇〇〇bp的DNA maker ;泳道2 :AlVg蛋白特异性肽链基因及pCznl载体片段；
[0036] 图5pCznl-AlVg特异性肽链基因序列利用诱导表达的经10%SDS-PAGE分析电泳 图；泳道M:为蛋白maker;泳道1 :未经诱导菌株的总蛋白；泳道2 :空载体诱导菌株的总 蛋白；泳道3 :经0. 5mMIPTG在37°C诱导靶标载体表达的总蛋白上清液；泳道4 :经0. 5mM IPTG在37°C诱导靶标载体表达的总蛋白包涵体；
[0037] 图6AlVg特异性肽链诱导表达，纯化后经10% SDS-PAGE电泳分析图谱；泳道M:为 蛋白maker ;泳道1 :经0. 5mM IPTG在37°C诱导靶标载体表达的总蛋白包涵体；泳道2 :纯 化后的革巴标蛋白；
[0038] 图7AlVg蛋白特异性肽链抗体纯化、电泳分离后，考马斯亮蓝染色图谱；
[0039] 图8利用特异性肽链抗体Western杂交AlVg蛋白图谱；泳道1:为250kd蛋白 maker。泳道2 :AlVg蛋白Western杂交图谱；
[0040] 图9整个生育期绿盲蝽AlVg基因表达量变化图谱；N1-N5,为1-5龄若虫；F1-F9， 为1-9日龄雌成虫；M1-M9,为1_9日龄雄成虫；
[0041] 图10不同寄主后饲养后绿盲蝽AlVg蛋白表达量分析图谱。
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