一个棉花bHLH转录因子基因GhFP1及其启动子的鉴定及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及棉花基因，具体是棉花basic helix-loop-helix (bHLH)家族中的一个 新成员基因GhFPl的表达及功能鉴定，以及其启动子纤维特异表达活性鉴定，进而应用于 棉纤维品质改良。
【背景技术】
[0002] 棉花是全世界最重要的经济作物之一。依照其基因组构成可分为异源四倍体棉 花（AADD)，以及二倍体棉花（AA)和（DD)。目前种植的棉花主要是异源四倍体棉花（约 占全部棉花种植面积的95%以上），二倍体棉花种植较少。异源四倍体棉花又分为陆地棉 (Gossypiumhirsutum)与海岛棉（G.barbadense)。陆地棉原产中美洲，其适应性广，是目 前种植最多的棉花种，占全部棉花种植面积的90%以上。随着纺织工业快速发展，人民生活 水平不断提高，纺织工业及其相关产业对棉纤维品质的要求愈来愈高。我国棉花产量据世 界第一位，但棉花纤维品质较差，因此，纤维品质问题已成为制约我国棉花产业可持续发展 的主要障碍之一。
[0003] 棉纤维是由种皮上突起的细胞产生的，每根纤维都是一个单细胞。而纤维长度是 衡量棉花纤维品质的一个重要指标，因此对调控细胞伸长基因的研宄对于改良棉纤维品质 具有重要意义。
[0004] 植物细胞伸长受到诸多因素的影响，生长素（Auxin)、赤霉素（GA)和油菜素内酯 (BR)等植物激素对细胞伸长具有重要促进作用。在拟南芥中研宄发现，上述3类激素对于 细胞伸长的调控机制最终都经过了一个HLH/bHLH家族转录因子相互作用的调控网络。虽 然还没有棉纤维发育中关于HLH/bHLH转录因子功能研宄相关的报道，但在对二倍体棉花 的基因组测序中发现了 200多个HLH/bHLH家族转录因子成员，暗示着HLH/bHLH转录因子 可能对棉纤维细胞发育具有重要作用。
[0005] HLH/bHLH家族转录因子广泛存在于真核生物中。该家族蛋白都具有一个约60个 氨基酸组成的bHLH结构域。该结构域又分为2个部分，位于N端的basic区域以及随后的 helix-loop-helix (HLH)区域。Basic区域一般由15到20个氨基酸残基组成，该区域主要 与DNA的结合有关。HLH结构域主要参与蛋白质之间的相互作用来形成同源或异源复合体， 从而发挥其对下游靶基因的调控作用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一个参与棉花纤维发育调控的新基因GhFPl，分析其启动 子活性，蛋白亚细胞定位和转录激活活性，蛋白质间的相互作用及其在转基因拟南芥和棉 花植株中产生的表型变化，以研宄其功能，为解析纤维细胞伸长的分子机制，改良棉花纤维 的品质提尚新的科学资料。
[0007] 采用比较基因组学和生物信息学等研宄方法，从棉花纤维cDNA文库中分离鉴定 了一些棉花HLH/bHLH家族基因，并对其中的GhFP1进行了研宄。分析表明，GhFP1cDNA全长 序列为1262bp，如SEQ.ID.No. 1所示，开放阅读框为1068bp，编码一个含355氨基酸的bHLH 蛋白质，蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.No. 2所示，分子量为39. 2kDa。
[0008] 利用染色体步移法（genomewalkingPCR)，分离克隆了长度为1061bp的GhFPl 启动子片段，如SEQ.ID.No. 3所示。将该启动子GhFPlpro与⑶S报告基因融合，构建了 pBI121-GhFPlpro:⑶S表达载体，转化棉花。分析了⑶S基因在棉花纤维等组织细胞中的表 达，表明该启动子在棉纤维发育过程中有较高的表达活性。
[0009] 为验证GhFPl基因编码的bHLH蛋白是否为转录因子，我们利用表1中的 GhFPl-ORF-L与GhFPl-ORF-R为引物克隆到了GhFPl的开放阅读框，构建相关的表达载体， 分析该蛋白的亚细胞定位及转录激活活性。构建了pBI121-GhFPl:GFP融合表达载体，转化 了拟南芥，观察转基因拟南芥幼苗的下胚轴，结果显示GhFPl:GFP融合蛋白定位于细胞核 中。
[0010] 为了分析该蛋白的转录激活活性，构建了pGBKT7-GhFPl和pGADI7-GhFPl表达载 体，分别转化酿酒酵母菌株Y187和AH109,进行划线及X-gal显色实验，结果显示GhFPl蛋 白具有转录激活能力。同时，我们在拟南芥中过量表达了GhFPl蛋白，观察发现GhFPl蛋白 的过量表达导致转基因拟南芥叶片表皮毛形态发生了明显改变，表皮毛体积变大，长度增 加。
[0011] 为进一步研宄GhFPl基因的功能，构建了由棉纤维特异启动子GhTUA9p(本发明人 克隆鉴定的纤维特异启动子，已申请获得的授权专利ZL2010 1 0028915. 5)驱动的GhFPl 过量表达及RNAi载体，转化棉花，获得了转基因棉花植株。对GhFPl过量表达转基因棉花 的成熟纤维进行了长度测量，结果显示过量表达GhFPl增加了棉花成熟纤维的长度。利用 定量RT-PCR分析了转基因棉花中一些纤维发育相关基因的表达情况，结果表明油菜素内 酯（BR)受体基因GhBRIl及参与BR合成的基因GhDWF4和Gh(PD的表达上调。离体胚培养 实验也显示GhFPl过量表达后，增强了棉纤维发育过程中对油菜素内酯合成抑制剂（BRZ) 的耐受。以上结果表明，GhFPl基因在棉纤维中的过量表达增加了BR信号，促进棉纤维伸 长发育。
[0012] 进而分离克隆了BR合成相关基因GhDWF4及GhCPD的启动子序列，对其进行了分 析，发现这两个启动子上都含有被bHLH家族转录因子识别的E-box (CANNTG)元件。表达纯 化了GhFPl蛋白，利用EMSA(electrophoretic mobility shift assay)实验验证蛋白与 DNA之间的相互作用，结果表明GhFPl蛋白能够与这些E-box序列相结合，调控这些基因的 功能表达，从而影响棉纤维伸长发育。
[0013] 利用酵母双杂交及pull-down实验分析了GhFPl蛋白与其他HLH/bHLH家族蛋白 的相互作用。结果显示GhFPl蛋白自身能形成同源二聚体，也能与其他HLH/bHLH蛋白之间 形成异源二聚体。
[0014] 本发明的优点：
[0015] 1、提供了一个棉花新基因GhFPl的全长cDNA序列及其编码的蛋白质序列，分析了 该蛋白的亚细胞定位和转录活性，证实了该基因编码的蛋白属于HLH/bHLH转录因子。
[0016] 2、提供了一个GhFPl基因上游启动子序列，分析证明该启动子在棉纤维发育过程 中有较高的特异表达活性。
[0017] 3、GhFPl基因在拟南芥中的过量表达能促进表皮毛细胞发育，导致表皮毛增大变 长；在棉花纤维中过量表达GhFPl导致油菜素内酯相关基因表达上调，促进纤维伸长发育， 成熟棉纤维长度增加。
[0018] 4、棉花HLH/bHLH蛋白之间存在一个相互作用网络，参与棉纤维的发育调节，在棉 纤维伸长发育过程中发挥重要作用。
【附图说明】：
[0019] 图1.GhFPl基因组织表达、GhFPl蛋白亚细胞定位及转录激活分析。
[0020] A.Real-timeRT-PCR分析GhFPl在棉花各组织中的表达（1，根；2,下胚轴；3,子 叶；4,叶；5,花瓣；6,花药；7胚珠；8, 3DPA纤维；9,OTPA纤维；10, 10DPA纤维；11，12DPA 纤维；12, 15DPA纤维；13, 20DPA纤维）。用表 1 中的GhFPl-RT-L、GhFPl-RT-R、GhUBIl-L 与GhUBIl-R为引物，不同棉花组织cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR，最后计算出GhFPl 表达量的相对值。B.GhFPl蛋白的亚细胞定位。箭头表示GFP荧光信号在细胞核中。 C.GhFPl蛋白转录激活分析。左图：显示pGBKT7-GhFPl及阳性对照pGBKT7-53转入酵母后 能在SD/-Trp-Ade培养基上生长，而阴性对照则不能生长；右图：pGBKT7-GhFPl及阳性对照 PGBKT7-53转入酵母后能在显色实验中显蓝色，而阴性对照不能显色。这说明GhFPl蛋白具 有转录激活能力。
[0021] 图2.GhFPl启动子在棉花纤维发育阶段中的活性分析。GhFPlp:⑶S转基因棉花 不同发育阶段胚珠及纤维⑶S染色分析。通过棉花遗传转化，获得了GhFPlp:⑶S转基因棉 花。对不同发育阶段的转基因棉花胚珠和纤维进行GUS染色，分析在GhFPl启动子驱动下 ⑶S基因表达活性（如果GhFPl启动子具有活性，则会激活下游⑶S报告基因表达，在染色 实验中产生蓝色反应）。（A) - (G)分别为开花当天（0天）及开花后1、3、5、10、15和20天 的棉花胚珠和纤维。
[0022] 图3.GhFPl过量表达转基因拟南芥叶片表型及表皮毛长度统计分析。
[0023] (A，B，C)野生型拟南芥第九片莲座叶及表皮毛；(D，E，F)GhFPl过量表达转基因 拟南芥株系LI;(G，H，I)GhFPl过量表达转基因拟南芥株系L2。（A，D，G)标尺为500ym; (C，F，I)标尺为100ym. (J)野生型和GhFPl过量表达拟南芥生长22天时第九片莲座叶上 表皮毛长度统计，误差值代表相对误差，**代表t-test中有极显著差异（P〈0. 01)。
[0024] 图4.GhFPl过量表达转基因棉花鉴定及纤维长度统计分析。
[0025]A.定量RT-PCR分析转基因棉花中GhFPl基因的表达。WT为野生型棉花，CK是从 转基因棉花中分离出来的非转基因植株，L5-5-1、L5-5-3、L14-1-2及L14-1-5为转基因棉 花的不同株系；B.Western-blotting检测棉纤维中GhFPl蛋白的积累。CK是从转基因棉花 中分离出来的非转基因植株，L5-5-l、L14-l-2及L14-1-5为转基因棉花的不同株系；C.转 基因棉花与野生型棉花纤维的长度比较。WT为野生型棉花，CK1和CK2是从转基因棉花中 分离出来的非转基因植株，其余为转基因棉花的不同株系；D.转基因棉花与野生型棉花纤 维长度统计。纵坐标表示纤维长度（fiberlength)，横坐标表示与C图相同。通过测量成 熟