Lamp1绿色荧光表达载体、其制备方法及应用
【专利说明】LAMP1绿色荧光表达载体、其制备方法及应用 【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及重组表达载体的构建，具体涉及一种LAMP1绿色 荧光表达载体、其制备方法及应用。 【【背景技术】】
[0002] 溶酶体（lysosome)是真核细胞中由单层脂蛋白膜包绕的含一系列酸性水解酶的 小体，是细胞内吞、细胞自噬两条代谢途径的共同终点。溶酶体既能通过与吞噬体融合，酸 化水解通过细胞内吞途径进入细胞的生物大分子物质，调节细胞水平的信号传递；又能通 过与自噬体融合，降解通过自噬途径包裹到自噬体中的细胞器和内源性生物大分子，为细 胞提供生物合成的新原料。通过荧光显微技术观察溶酶体的亚细胞定位对于研究细胞内 吞、细胞自噬两条代谢途径意义重大。传统的应用于观察溶酶体的方法主要是免疫荧光染 色和电镜观测两种方法，其中，免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的 抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原）作为分子探针检 查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)，在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有突光 素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红 色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技 术测定含量，使用抗体将溶酶体体特异性表达的蛋白质LAMP1上标记上荧光信号，可以用 荧光显微镜下或激光共聚焦显微镜观察溶酶体的亚细胞定位；而电镜是利用电子与物质作 用所产生之讯号来监定微区域晶体结构，微细组织，化学成份，化学键结和电子分布情况的 检测手段。使用电镜技术通过观测细胞切片或组织切片中细胞微细结构，依据形态可鉴别 溶酶体。
[0003] 以上两种方法中，使用免疫荧光鉴定溶酶体依赖于高效价的LAMP1抗体，这样不 仅步骤繁琐，而且实验成本高；而用电镜法鉴定溶酶体体，依赖于研究人员丰富的形态学分 析经验，难度比较大，不易于普及；而且上述两种方法都需要先将细胞固定灭活后，再检测， 无法进行活细胞观察。 【
【发明内容】
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[0004] 本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种LAMP1绿色荧光表达载体，解决 现有技术中溶酶体靶细胞定位检测中步骤繁琐、实验成本高以及无法进行活细胞检测的技 术问题。
[0005] 本发明为解决上述技术问题所采用的方案如下：
[0006] 一种一种LAMP1绿色荧光表达载体，表达LAMP1和绿色荧光蛋白的融合蛋白，所述 表达载体以pEGFP-cl载体为骨架载体，在pEGFP-cl载体多克隆位点融合了LAMP1编码基 因。
[0007] 优选地，所述LAMP1编码基因位于pEGFP-cl载体的EcoRI/BamHI之间。
[0008] 优选地，所述表达载体的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNo:5。
[0009] 本发明还提供了一种制备LAMP1绿色荧光表达载体的方法，包括如下步骤：
[0010] 步骤1 :用人类子宫颈癌细胞Hela细胞的CDNA作为模板进行PCR扩增，获得含有 EcoR I和BamH I酶切位点的LAMP1 DNA片段，其中，所述PCR扩增引物为序列表中的SEQ ID No :1 和 SEQ ID No :2 ;
[0011] 步骤2 :将所得LAMP1DNA片段和pEGFP-cl载体分别用EcoR I和BamH I进行双 酶切，得到LAMP1基因和酶切后的pEGFP-cl载体；
[0012] 步骤3 :将所得LAMP1基因和酶切后的pEGFP-cl载体用DNA连接酶进行连接，得 至lj pEGFP-cl-LAMPl 载体。
[0013] 优选地，所述步骤1中PCR扩增的反应条件为：起始98°C5min;然后98°C10s， 58°C30s，70°C2min，进行 35 个循环；最后 72°ClOmin。
[0014] 优选地，所述步骤2中LAMP1基因和酶切后的pEGFP-cl载体的质量比为 2. 5:1-5:1 ;所述步骤2中所用的DNA连接酶为T4DNA连接酶。
[0015] 优选地，所述步骤2和所述步骤3之间还包括如下步骤：
[0016] 将所得LAMP1基因和酶切后的pEGFP-cl载体进行纯化。
[0017] 本发明还提供了用上述的表达载体转染的细胞，其中，所述细胞为真核细胞。
[0018] 本发明还提供了一种细胞检测试剂，包括上述的表达载体。
[0019] 本发明另外还提供了上述的表达载体或上述的细胞检测试剂在检测溶酶体在靶 细胞中定位的用途。
[0020] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于，本发明的种LAMP1绿色荧光表达载体 能够表达LAMP1和绿色荧光蛋白的融合蛋白，将溶酶体进行荧光标记，能够对活体靶细胞 中溶酶体的定位进行检测并在显微镜下观察，操作简单，实验成本低。 【【附图说明】】
[0021] 图1是本发明实施例的pEGFP-cl载体结构图。 【【具体实施方式】】
[0022] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施 例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于限定本发明。
[0023] 除非另有定义，本发明使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相 同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员可参考Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一 的标准3字母和/或1字母代码。
[0024] 尽管本发明的广义范围所示的数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自 测量中存在的标准偏差所致。另外，本发明公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何 和所有子范围。例如记载的"1至10"的范围应理解为包含最小值1和最大值10之间(包 含端点）的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至 6. 1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5. 5至10。另外，任何称为"并入本文"的 参考文献应理解为以其整体并入。
[0025] 另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非 清楚且明确的限于一个所指对象。术语"或"可与术语"和/或"互换使用，除非上下文另 有清楚指明。
[0026] 术语"部分"和"片段"可互换的指代多肽、核酸或其他分子构建物的一部分。
[0027] 绿色荧光蛋白（GFP)来源于维多利亚多管发光水母，经基因工程改造后的突变型 GFP蛋