miR-24作为血浆/血清miRNA检测的内参基因的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及miR-24作为血浆/血清miRNA检测的内参基因的应用。
【背景技术】
[0002] MicroRNAs(即miRNAs)是近年来发现的一类长约18-24个核苷酸的非编码小RNA， 在基因组中占1-3%，但预计其可以调控30%的基因表达。miRNA首先在细胞核内由RNA聚 合酶II转录生成pri-miRNA，pri-miRNA经Drosha核酸酶处理生成70个核苷酸左右的 pre-miRNA，并通过Exportin-5依赖的转运机制运送至胞楽。在胞楽中pre-miRNA经Dicer 核酸酶进一步剪切成为成熟的miRNA。成熟miRNA以互补配对的方式与靶mRNA的3'-UTR 区、5'-UTR区甚至开放读码框结合，造成靶mRNA的降解或转录抑制。MiRNA的互补配对并非 绝对互补，因此同一个miRNA可以调控多个mRNA，同时同一个位点也可能同时受多个miRNA 调控。
[0003] 目前大量文献证实miRNA涉及生理、病理，包括增殖、分化、迁移、凋亡等几乎所有 过程，与许多疾病的发生发展密切关联，同时在这些疾病中都检测到其与正常组织的差异 表达情况，因此miRNA已经成为包括肿瘤在内的多种疾病的诊断、分型以及预后的候选标 志物。
[0004] 血液游离核酸作为疾病标志物始于1948年。由于核酸检测手段多样，定量简便， DNA和RNA相继成为研究热点。但DNA特异性较差且不能实时反应变化情况，而RNA在血液 中非常容易降解，不够稳定。MiRNA作为新兴研究热点，具有在血清/血浆中稳定性好，对酸 碱、反复冻融（10次)、常温放置（24小时)以及RNA酶等均不敏感的特性，表达稳定。血液游 离miRNA来源非常复杂，包括血细胞miRNA释放，组织细胞中直接渗出miRNA等，在癌症患 者中还包括肿瘤组织胞外体和超微小泡的外泌作用释放miRNA等，无论其来源如何，血液 游离miRNA以其表达稳定、易检测、具有疾病特异性等特点成为优质血液来源生物标志物。
[0005] 目前研究人员常用于血清/血浆控制miRNA表达差异的方法有三种：一是利用所 有可检测到的miRNA的平均值作为参照；二是利用血清/血浆总体积作为参照；三是利用 外源添加的非人类定量miRNA作为参照。以上方法都解决了部分差异控制的问题，但都存 在一定的缺陷：第一种方法仅限于高通量的检测平台，如高通量测序、miRNA芯片等技术， 在低通量检测平台检测少量特定的miRNA时无法使用；第二、三种方法可以有效控制实验 技术带来的差异，但无法控制个体本身的生物学差异。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供miR-24作为血浆/血清miRNA检测的内参基因的应用。
[0007] 本发明要求保护miR-24作为内参基因的应用。
[0008] 所述应用中，所述miR-24具体作为血浆或血清中miRNA检测的内参基因。
[0009] 所述应用中，所述miR-24具体作为单独的内参基因（即无需与其他内参基因组合 使用）。
[0010] 本发明还保护一种检测血浆或血清中miRNA的相对表达量的方法，包括如下步 骤：
[0011] (1)提取待测血浆或血清的总RNA并反转录为CDNA;
[0012] (2)以步骤（1)获得的cDNA为模板，分别检测其中目的miRNA的编码序列的含量 和miR-24的编码序列的含量；
[0013] (3)根据步骤（2)的结果，以所述miR-24为内参基因，计算目的miRNA的相对表达 i 里〇
[0014] 所述方法应用于非治疗目的和非诊断目的。
[0015] 本发明还要求保护用于检测血浆或血清中miR-24的物质的应用；所述应用为：以 miR-24为内参基因，检测其它miRNA相对于所述内参基因在血浆或血清中的相对表达量。
[0016] 本发明还要求保护用于检测血浆或血清中miR-24的物质在制备试剂盒中的应 用；所试剂盒的用途为：以miR-24为内参基因，检测其它miRNA相对于所述内参基因在血 浆或血清中的相对表达量。
[0017] 本发明还保护一种试剂盒,含有用于检测血浆或血清中miR-24的物质；所试剂盒 的用途为：以miR-24为内参基因，检测其它miRNA相对于所述内参基因在血浆或血清中 的相对表达量。所述试剂盒可为基于real-timePCR的试剂盒，如基于Taqman探针法的 real-timePCR试剂盒或基于突光染料法的real-timePCR试剂盒。
[0018] 以上任一所述miR-24如序列表的序列1所示。
[0019] 以上任一所述血浆或血清可来源于结直肠癌患者、肺癌患者或健康人。
[0020] 采用miR-24为内参基因可以实现不同实验室间研究结果的比较，促进各实验结 果的归一化处理，进而促进血清/血浆miRNA研究结果向临床成果转化，为临床医生提供更 加精确的诊断、分型、预后判断以及个体化治疗的有力工具。
[0021] miRNA作为新型生物标志物，在血清/血浆中受内外因素干扰较小、表达稳定、检 测手段多样、定量检测精确。因此以miRNA作为血清/血浆中的内参基因有助于外周血标 志物在诊断、分型以及预后等方面的价值转化以及不同实验室间检测结果的对比。以单个 miRNA作为血清或血浆中的内参基因，适用于高、低通量的检测平台，对于大规模临床检测 应用，降低了操作难度，简化了操作流程。
【具体实施方式】
[0022] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。miR为单链RNA，实施例中提供的各个miR的序列均为5' 一 3'方向。
[0023] 实施例1、通过TLDA芯片筛选候选内参基因
[0024] 利用TLDA芯片分别检测已经医院确诊但未经任何治疗的结直肠癌患者、肺癌患 者和健康人的血浆miRNA的表达谱及含量，分析不同病例和对照间miRNA表达的稳定性和 表达量，筛选得到稳定高表达的miRNA作为候选内参miRNA。
[0025] 1、血浆样本的制备
[0026] 分别采集已经医院确诊但未经任何治疗的结直肠癌患者（49人)、肺癌患者（6人） 和健康人（58人）的血浆。
[0027] 将结直肠癌患者分为5组，相关信息见表1。 [0028] 表1结直肠癌患者的信息
【主权项】
1. miR-24作为内参基因的应用；所述miR-24如序列表的序列1所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用中，所述miR-24作为血浆或血清 中miRNA检测的内参基因。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述应用中，所述miR-24作为单独的 内参基因。
4. 一种检测血浆或血清中miRNA的相对表达量的方法，包括如下步骤： (1)提取待测血浆或血清的总RNA并反转录为cDNA ; (2)以步骤（1)获得的cDNA为模板，分别检测其中目的miRNA的编码序列的含量和 miR-24的编码序列的含量；所述miR-24如序列表的序列1所示； (3)根据步骤（2)的结果，以所述miR-24为内参基因，计算目的miRNA的相对表达量。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法应用于非治疗目的和非诊断目的。
6.用于检测血浆或血清中miR-24的物质的应用；所述应用为：以miR-24为内参基因， 检测其它miRNA相对于所述内参基因在血浆或血清中的相对表达量；所述miR-24如序列表 的序列1所示。
7.用于检测血浆或血清中miR-24的物质在制备试剂盒中的应用；所试剂盒的用途为： 以miR-24为内参基因，检测其它miRNA相对于所述内参基因在血浆或血清中的相对表达 量；所述miR-24如序列表的序列1所示。
8. -种试剂盒，含有用于检测血浆或血清中miR-24的物质；所试剂盒的用途为：以 miR-24为内参基因，检测其它miRNA相对于所述内参基因在血浆/血清中的相对表达量； 所述miR-24如序列表的序列1所示。
【专利摘要】本发明公开了miR-24作为血浆/血清miRNA检测的内参基因的应用。本发明还保护一种检测血浆或血清中miRNA的相对表达量的方法，包括如下步骤：（1）提取待测血浆或血清的总RNA并反转录为cDNA；（2）以步骤（1）获得的cDNA为模板，分别检测其中目的miRNA的编码序列的含量和miR-24的编码序列的含量；（3）根据步骤（2）的结果，以所述miR-24为内参基因，计算目的miRNA的相对表达量。采用miR-24为内参基因可以实现不同实验室间研究结果的比较，促进各实验结果的归一化处理，进而促进血清/血浆miRNA研究结果向临床成果转化，为临床医生提供更加精确的诊断、分型、预后判断以及个体化治疗的有力工具。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104711338
【申请号】CN201310681099
【发明人】孙义民, 凌兵, 郭素堂, 陈照丽, 李耀平, 赫捷, 邢婉丽, 程京
【申请人】博奥生物集团有限公司, 清华大学, 山西省肿瘤医院, 中国医学科学院肿瘤医院
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2013年12月12日