一种埃博拉病毒分型荧光pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明提供一种埃博拉病毒分型荧光PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 埃博拉病毒（EBOV)属丝状病毒科（Filiviridae)，为不分节段的单股负链RNA 病毒。病毒呈长丝状体，可呈杆状、丝状、"L"形等多种形态。毒粒长度平均lOOOnm，直径 70-90nm。病毒有脂质包膜，包膜上有呈刷状排列的突起，主要由病毒糖蛋白组成。埃博拉 病毒基因组是不分节段的负链RNA，大小为18. 9kb，编码7个结构蛋白和1个非结构蛋白。
[0003] EB0V可在人、猴、豚鼠等哺乳类动物细胞中增殖，其中Vero-98、Vero_E6、 Hela-229细胞最敏感。病毒接种后，6-7小时出现细胞病变，表现为细胞圆化、皱缩，细胞质 内可见纤维状或颗粒状结构的包含体。给猕猴接种埃博拉病毒后可产生与人类疾病相似的 症状体征并引起死亡。在鸟类、爬行类、节肢动物和两栖类动物细胞内不能复制，在仓鼠与 豚鼠中，需多次传代才能引起死亡。
[0004] 埃博拉病毒包括五种亚型：扎伊尔型、苏丹型、本迪布焦型、塔伊森林型、莱斯顿 型。前四种亚型埃博拉病毒已证实能够致人类疾病。不同亚型毒力不同，扎伊尔型毒力强， 人感染后病死率高，苏丹型次之，本迪布焦型更次，塔伊森林型对黑猩猩有致死性，但对人 的毒力较弱。莱斯顿型对非人灵长类动物有致死性，而人感染后不发病。不同亚型病毒糖 蛋白的基因组核苷酸构成差异较大（同源性为34% -43%)，但同一亚型的病毒基因组相对 稳定，遗传特性很少发生变化。
[0005] 埃博拉出血热（Ebolafeve)是由埃博拉病毒（Ebolavirus,EB0V)引起的一种急 性出血性传染病。主要通过接触病人或感染动物的血液、体液、分泌物和排泄物等而感染， 临床表现主要为突起发热、出血和多脏器损害。埃博拉出血热病死率高，可达50% -90%。 本病于1976年在非洲首次发现，主要在乌干达、刚果、加蓬、苏丹、科特迪瓦、南非、几内亚、 利比里亚、塞拉利昂、尼日利亚等非洲国家流行。
[0006] 接触传播是本病最主要的传播途径。病人或动物的血液及其他体液、呕吐物、分泌 物、排泄物（如尿、粪便）等均具有高度的传染性，可以通过接触病人和亚临床感染者（特 别是血液、排泄物及其他污染物）而感染。病人自急性期至死亡前血液中均可维持很高的 病毒含量，医护人员在治疗、护理病人时、或处理病人尸体过程中容易受到感染，病人的转 诊还可造成医院之间的传播。医院内传播是导致埃博拉出血热暴发流行的重要因素。此外， 吸入感染性的分泌物、排泄物、未经消毒的注射器等也可造成感染。
[0007] 本病潜伏期为2-21天，一般为5-12天。感染埃博拉病毒后可不发病或呈轻型，非 重病患者发病后2周逐渐恢复。典型病例为急性起病，临床表现为高热、畏寒、头痛、肌痛、 恶心、结膜充血及相对缓脉。发病2-3天后可有恶心、呕吐、腹痛、腹泻、粘液便或血便等表 现，半数病人可有咽痛及咳嗽。病后4-5天进入极期，发热持续并出现神志的改变，如谵妄、 嗜睡等。重症病人在发病数日可出现不同程度的出血倾向，有咯血，鼻、口腔、结膜、胃肠道、 阴道及皮肤出血或血尿，病后第10日为出血高峰，50%以上的患者出现严重的出血，并可 因出血、肝肾功能衰竭及致死性并发症而死亡。病人最显著的表现为低血压、休克和面部 水肿，还可出现DIC、电解质和酸碱的平衡失调等。90%的死亡患者在发病后12天内死亡 (7-14天）。急性期并发症有心肌炎、细菌性肺炎等。由于病毒持续存在于精液中，也可引 起睾丸炎、睾丸萎缩等迟发症。在病程第5-7日可出现麻瘆样皮瘆，以肩部、手心和脚掌多 见，数天后消退并脱肩，部分患者可较长期地留有皮肤的改变。目前对埃博拉出血热尚缺乏 特效治疗方法，主要是对症和支持治疗。
[0008] 临床早期诊断埃博拉出血热相当困难，因其症状无特殊性，不易与其他病毒性出 血热如拉沙热、黄热病、马尔堡出血热、克里米亚一刚果出血热、肾综合征出血热等鉴别。可 以参考这些疾病的流行病学特点，主要是流行地区、流行季节等进行鉴别。确诊主要依靠实 验室检测，具体方法如下：
[0009] ( -）血清学检测
[0010] 患者最早可在症状出现后7-10天从血清中检出特异性IgM、IgG抗体，IgM抗体可 维持3个月，IgG抗体可维持很长时间。多数患者抗体出现于起病后10-14天，也有重症病 人至死也未能检出抗体，故IgG抗体检测主要用于血清流行病学调查，IgM抗体可作为近期 感染的血清流行病学调查指标，但不能满足早期诊断的需要。血清特异性IgM抗体多采用 IgM捕捉ELISA法检测；血清特异性IgG抗体多采用ELISA、免疫荧光等方法检测。
[0011] (二）病原学检测
[0012] 埃博拉病毒高度危险，与活病毒相关的实验必须在BSL-4实验室进行。病原学检 测包括如下三个方面。病毒抗原检测：由于埃博拉出血热有高滴度病毒血症，可采用ELISA 等方法检测血清中病毒抗原。免疫荧光法应用也很广泛，它可从感染动物肝、脾中检测病毒 抗原。病毒分离：采集发病一周内患者血清标本，用Vero细胞进行病毒分离培养。核酸检 测：采用RT-PCR等核酸扩增方法检测。一般发病后一周内的病人血清或血浆中可检测到病 毒核酸。
[0013] 以下实验室结果均可确诊：病毒抗原阳性；血清特异性IgM抗体阳性；恢复期血清 特异性IgG抗体滴度比急性期有4倍以上增高；从患者标本中检出埃博拉病毒RNA ;从患者 标本中分离到埃博拉病毒。
[0014] 埃博拉病毒血清学检测、病毒抗原检测检测时间长，灵敏度低；病毒的分离培养是 诊断的金标准，分离培养的病毒可用于其它研宄，但是分离培养的过程耗时长，需要16-21 天，且需要严格的实验条件。近年发展的逆转录PCR(RT-PCR)，巢式PCR(nestedPCR)技术 将病毒RNA检测的特异性和灵敏度大大提高，而实时荧光PCR的出现又将此检测技术推向 了另一台阶。实时荧光PCR作为一种现代分子生物学基因诊断技术，具有高度敏感性和特 异性，能在数小时内检出痕量病原，为埃博拉病毒早期快速诊断提供了敏感、快速、实用的 方法。
[0015] 通过荧光PCR的方法直接检测埃博拉病毒RNA，大大提高埃博拉病毒感染的检测 准确性，有利于疾病的早期诊断，荧光PCR方法与其它检测方法相比具有以下优势：（1)与 免疫学检测比较，具有更高的灵敏度，从理论上讲只要有一个基因拷贝就可以检测出来。 (2)根据各种病原体独特的保守基因序列设计引物，能够保证PCR反应的高度特异性，避免 交叉反应。（3)能对病毒进行定量或定性检测，可反映出患者体内病原体拷贝数的高低和复 制情况。定量检测有助于判断病原体感染与疾病发生和发展的关系，探讨药物对病原体的 作用，了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况。这对理解发病机制和预测抗病毒治疗 的有效性十分关键。（4)可扩大检测人群的范围，适用于大规模的流行病调查。对埃博拉病 毒这类自然感染率极高的病原微生物尤其适用。（5)将PCR敏感性与探针特异性相结合，在 很大程度上改变了传统PCR的缺陷，缩短了反应时间，简化了操作步骤。（6)全过程均在单 管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阴性和环境污染。（7)实时检测技术可 连续不断的检测PCR过程中微弱信号的变化，避免了传统PCR的"平台期效应"，并且模板的 定量不通过终产物，而由Ct值算出，准确性和灵敏性都有提高。（8)通过采用不同反应管或 不同荧光探针的标记可以区分具体的病毒基因型，可以有效地监测EBOV感染的变化，判断 病毒致病性的强弱，并且为治疗性的疫苗研发提供科学数据。
[0016] 结合目前现状，在临床埃博拉瘤病毒感染的实验诊断中，实时荧光PCR技术凭借 着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性。但是现有试剂盒缺乏完善的质控 体系，且还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确诊断的需要。
[0017] 国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测埃博拉病毒的试剂盒，这些试 剂盒所提供的EBOV-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。但酚-氯仿法操作繁琐， 对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；而 柱提取方法虽无需高速离心，但是需频繁更换离心管，且提取用时长，特异性较差。另外，受 限于其引物探针序列，本领域还需开发出一种检测埃博拉病毒特异性好且综合性能优良的 PCR检测试剂盒。尤其是提供一种能对EBOV进行分型检测的试剂盒。
【发明内容】
[0018] 本发明的目的在于解决现有埃博拉病毒荧光定量PCR检测试剂盒的缺陷，提供一 种操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检