具有烯基磺酰基团的荧光标记分子及其标记蛋白质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白质巧光标记技术领域，具体设及具有締基横酷基团的巧光标记分 子及其标记蛋白质的方法。
【背景技术】
[0002] 利用某些物质对蛋白质标记从而对其进行检测分析的方法有多种，常用的方法有 同位素标记，巧光标记等。同位素标记对人体危害较大，同时也需要配备特殊仪器，故目前 该法使用较少；但它可W达到定量检测分析的目的。使用更为广泛的是利用巧光素对蛋白 质进行标记。
[0003] 目前巧光素对蛋白质进行标记的方法中，所采用的连接分子主要是班伯酷亚胺醋 和异硫氯酸醋。班伯酷亚胺醋是比较可靠的修饰蛋白的基团，而且易于保存，但是该连接基 团也容易和蛋白上的琉基反应，在水相中稳定性也较差。异硫氯酸醋在水中的稳定性比异 氯酸醋有了很大的提高，但是用异硫氯酸醋标记后的蛋白质偶联物稳定性较差。因此，开发 新的用于蛋白质巧光标记的连接分子具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是，提供具有締基横酷基团的巧光标记分子及其标记蛋白质的方 法。旨在解决现有技术中蛋白质巧光标记的连接分子或蛋白偶联物稳定性较差的技术问 题。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0006] 一种具有締基横酷基团的巧光标记分子，其结构如式（I)所示：
[0007]
【主权项】
1. 一种具有烯基磺酰基团的荧光标记分子，其结构如式（I)所示：
其中，R为荧光基团。
2. 如权利要求1所述的具有烯基磺酰基团的荧光标记分子，其特征在于：该荧光标记 分子为式（II )、式（III)、式（IV)、式（V )、式（VI)或式（VE)的化合物，
其中，Rp馬独立选自H或者含有1到6个碳原子的直链或支链烷基或环烷基； X为〇、S或者NR3，所述R3选自H或者含有1到6个碳原子的直链或支链烷基或环烷 基； Y为〇或者CH2, η为0-5的整数。
3.权利要求2所述的式（III)化合物的制备方法，该方法为：
其具体步骤为： (1) 将化合物1与二碳酸二叔丁酯反应得到化合物2 ; (2) 将化合物3和二氯亚砜反应得到化合物4 ; (3) 将化合物2和有机碱溶解在有机溶剂中，加入化合物4,反应完成后经过后处理得 到化合物5 ; (4) 化合物5脱保护基得到化合物6 ; (5) 化合物6和三乙胺的二氯甲烷溶液中加入2-氯乙烷磺酰氯，反应完成后经过后处 理得到式（III)化合物。
4. 权利要求2所述的式（IV )化合物的制备方法，该方法为：
其具体步骤为： 化合物8和三乙胺的二氯甲烷溶液中加入化合物7反应完成后，经过后处理得到式 (IV )化合物。
5. 权利要求2所述的式（V )化合物的制备方法，该方法为：
其具体步骤为： (1) 将化合物8和化合物9用DCC处理得到化合物10 ; (2) 化合物10脱保护基得到化合物11 ; (3) 化合物11和三乙胺的二氯甲烷溶液中加入化合物7,反应完成后经后处理得到式 (V )化合物。
6. 权利要求2所述的式（VI)化合物的制备方法，该方法为：
其具体步骤为： 化合物12和三乙胺的二氯甲烷溶液中加入化合物7,反应完成后经过后处理得到式 (VI)化合物。
7. 权利要求2所述的式（W )化合物的制备方法，该方法为：
其具体步骤为： (1) 将化合物12和化合物9用DCC处理得到化合物13 ; (2) 化合物13脱保护基得到化合物14 ; (3) 化合物14和三乙胺的二氯甲烷溶液中加入化合物7,反应完成后经过后处理得到 式（VE)化合物。
8. 权利要求1或2所述的具有烯基磺酰基团的荧光标记分子在蛋白质荧光标记中的应 用。
9. 权利要求1或2所述的具有烯基磺酰基团的荧光标记分子与蛋白质偶联的方法，该 方法为：所述烯基磺酰基团的烯基与蛋白质中氨基酸的氨基通过迈克尔加成反应，实现与 蛋白质的偶联。
10. 如权利要求9所述的具有烯基磺酰基团的荧光标记分子与蛋白质偶联的方法，其 特征在于：所述烯基与氨基的迈克尔加成反应在碱性磷酸缓冲液或者含有氨基的Tris缓 冲液中进行反应。
【专利摘要】本发明公开了具有烯基磺酰基团的荧光标记分子以及该荧光标记分子对蛋白质进行标记的方法。通过烯基磺酰氨基与荧光基团连接获得所述荧光标记分子。该荧光标记分子通过其具有的烯基与蛋白质中氨基酸的氨基发生迈克尔加成反应，使荧光标记分子与蛋白质偶联在一起。本发明中，烯基磺酰氨基能提高所述荧光标记分子的溶解度，并且烯基磺酰氨基在水中具有很高的稳定性，其中的烯基能在比较温和的条件与蛋白质的氨基发生迈克尔加成反应，例如在磷酸缓冲液和Tris缓冲液中均可进行反应，所述荧光标记分子与蛋白质偶联后，在人血清中的稳定性也有很大提高，在蛋白质荧光标记中具有很好的应用前景。
【IPC分类】C07K1-13, C07D311-12, C09K11-06, C07D493-10, C07D311-16
【公开号】CN104725338
【申请号】CN201510072342
【发明人】姜标, 曹刚, 杨建平
【申请人】中国科学院上海高等研究院
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年2月11日