一种分离dna结合蛋白并精确定位其dna结合位点的方法

文档序号:8406474阅读:1740来源:国知局
一种分离dna结合蛋白并精确定位其dna结合位点的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及DNA结合蛋白,具体地说,设及一种分离DNA结合蛋白并精确定位其 DNA结合位点的方法。
【背景技术】
[0002] 目前对启动子DNA结合蛋白的研究方法可分为两大类。第一类是细胞内方法, W已知的启动子DNA序列筛选与其相结合的蛋白编码基因,通过生物信息学分析来确定 该蛋白质,如酵母单杂交系统(yeastonehybridsystem,Y1H)、瞻菌体展示技术(phage display,PD)等。第二类是细胞外法,即在体外用重组的已知蛋白质与启动子DNA结合,如 凝胶阻滞实验、面aseI足迹试验等。
[0003] 细胞内方法由于是细胞内筛选,符合生理状态,适合高通量筛选用于寻找未知基 因及蛋白质,但是只能筛选可与启动子DNA特异性结合的蛋白,但不能检查出精确的蛋白 质结合位点,而且其特异性需要进一步验证。细胞外法可W查出精确的蛋白质结合位点,但 效率低下、操作复杂,一般不用于寻找未知基因及蛋白质。

【发明内容】

[0004] 为了解决现有技术中存在的问题,本发明的目的是提供一种可W寻找潜在DNA结 合蛋白并且可W对其与DNA结合位点进行精确定位的方法。
[0005] 为了实现本发明目的,本发明的技术方案如下:
[0006] 一种分离DNA结合蛋白并精确定位其DNA结合位点的方法,
[0007] 分离DNA结合蛋白;通过利用带有生物素标记的引物PCR扩增待研究DNA片段, 先后加入核蛋白或胞质蛋白和亲和素包被的磁珠,共同解育,洗去非特异结合的蛋白,加入 SDS使蛋白质变性释放,鉴定蛋白质;
[000引该样扩增的每个PCR片段末端都带有一个生物素基团,生物素与亲和素包被磁 珠(Str巧tavidinSe地arose)结合,而亲和素包被磁珠又可W与带吸力真空准备工具 (vacuumpr巧tool)结合,从而被分离出来。
[0009] 定位蛋白质的DNA结合位点:W待研究的DNA片段为模板,采用不同的引物通过 PCR反应获得相互重叠的DNA片断,根据相互重叠的DNA片断对结合蛋白亲和力的差异定位 结合蛋白的DNA结合位点。
[0010] 进一步地,所述方法具体包括如下步骤:
[0011] S1;DNA片段的扩增;
[001引 W待研究的DNA片段为模板,利用带有生物素标记的引物通过PCR反应进行 扩增;经1 %琼脂糖凝胶电泳,切下带有目的片断的凝胶回收纯化,获得纯的DNA片断 (0. 5-3.Oug);
[001引 S2;蛋白质的分离;
[0014] PCR产物中加入核蛋白或胞质蛋白,共同解育;
[0015] 加入亲和素包被的磁珠,共同解育;
[0016] 缓冲液洗去非特异结合的蛋白;
[0017] 加入SDS使蛋白质变性释放,鉴定蛋白质;
[00化]S3 ;定位蛋白质的DNA结合位点;
[0019] W待研究的DNA片段为模板,采用不同的引物通过PCR反应获得相互重叠的DNA 片断;
[0020] 根据上述相互重叠的DNA片断对结合蛋白亲和力的差异定位结合蛋白的DNA结合 位点。
[002U 更进一步地,所述待研究的DM片段为200-3(K)bp。
[0022] 所述步骤S1中任意一条引物的5'末端采用生物素标记。
[0023] 进一步地,所述步骤S2具体为:
[0024] 1)在96孔板中预先加入30yLdd&O;
[002引 2)100化PCR产物中加入50化核蛋白或胞质蛋白,37°C解育15分钟;
[0026] 扣StreptavidinSe地arose?HP(链霉亲和素琼脂糖凝胶)混匀,取6yL加入到 46uLbindingbuffer(结和缓冲液),W吸头混匀5分钟,混合物加入到含有PCR产物-蛋 白混合物的96孔PCR反应板;
[0027] 4)在Vacuumprepworkstation(真空准备工作站)中,四个样品板中依次加入 180ml高纯水、Denaturationbuffer(变性缓冲液)、washingbuffer(清洗缓冲液)和 PBS(磯酸缓冲液);
[002引 5)打开vacuumprepworkstation(真空准备工作站)的抽气累,将vacuumprep tool(真空准备工具)在高纯水中清洗30秒;
[0029] 6)将vacuumpr巧tool(真空准备工具)移到PCR板中,抓取亲和素包被磁珠-生 物素-DNA-蛋白质复合物;
[0030] 7)将vacuumpreptool(真空准备工具)在Dena1:urationbuffer(变性缓冲 液)、washingbuffer(清洗缓冲液)或PBS(磯酸缓冲液)中洗漆15秒;
[003U 8)关掉抽气累,将vacuumpr巧tool(真空准备工具)放入含有超纯水的96孔板 中,摇动,释放混合物;
[003引 9)吸取混合物,放入离屯、管中,-20°C保存;
[003引 10)DNA结合蛋白的鉴定。
[0034] 其中,DNA结合蛋白的鉴定通过本领域常规方法鉴定,如;SDS-PAGE、凝胶阻滞实 验室或色谱法鉴定。
[0035] 本发明的有益效果在于:
[0036] 本发明采用生物素-亲和素作用方法来确定与启动子结合蛋白,方法简便易行, 且周期较短;并且通过PCR反应控制PCR产物的长度和位置,且能方便的引入基因突变,W 及适应于大通量的筛选,因此该方法即可用于大通量的分析与DNA结合的蛋白质,又可准 确定位蛋白在DNA上的作用位点,并可通过引入突变来判断其与位点的结合特异性。
【附图说明】
[0037] 图1为本发明实施例中样本在12%的SDS-PAGE上电泳图;
[003引蛋白质分子量标准自上至下分别是97、66、44、31、21和141^);1和2分别是提取的 核蛋白和胞质蛋白,D1和D2分别是处理后经dena化rationbuffer洗漆的核蛋白和胞质 蛋白,化和W2分别是处理后经washingbuffer洗漆的核蛋白和胞质蛋白,P1和P2分别是 处理后经PBS洗漆的核蛋白和胞质蛋白。
[0039] 图2为本发明实施例中与启动子片段结合的蛋白的凝胶阻滞试验检测结果。
[0040] 图3为本发明所述分离DNA结合蛋白并精确定位其DNA结合位点的方法示意图。
【具体实施方式】
[0041] 本实施例WhCLP46基因启动子CpG岛结合蛋白为例,用于说明本发明技术方案, 但不用来限制本发明的范围。
[00创实施例1hCLP46基因启动子CpG岛结合蛋白的分离与结合位点的定位 [004引 l、hCLP46启动子区的扩增
[0044] 应用PrimerPremier5.0设计引物(表1),100uL反应体系中包含10XPCR Buffer10uL,2. 5mMdNTPmix8yL,各 4.OuLlOuM上、下游引物,2.OuLU937DNA, l.OyL5U/yL化qCTakaRa)和71.0yLd地20。混合物混匀离屯、后在PCR仪上执行扩增 反应(95°C3min;95°C30s,59°C30s,72°CImin,45cycles;72°C5min;4°Cforever)。
[0045] 表1h化P46启动子扩增引物
[0046] 基因名称_序列(5,一3)_片断长度
[0047] _(bp) hCLP46 F Biotin-CAACTGGTCCATTCGTTTATC 490 启动子民TCCAGAGCAGGAGCAGAG_
[0048] 2、U937细胞胞质蛋白和核蛋白提取
[0049] U937细胞按照上述方法进行培养,使用核蛋白和胞质蛋白提取试剂盒(南京凯 基)提取细胞核蛋白和胞质蛋白,简略步骤如下:
[0050] 1)取培养的U937细胞5X106~lX107个/mL,弃去培养液,细胞用预冷的PBS洗 漆两遍;
[0化^ 2)用1血预冷的PBS洗漆细胞后转移至预冷的1. 5血微量离屯、管中;
[0052] 3)4°C离心500Xg,3min收集细胞,用移液枪尽可能取去上清,勿留残液,估计细 胞压积PCV (离屯、后的紧实细胞体积);
[005引4)每20 y 1细胞压积中,加入200 y 1预冷的Buffer A (使用前每血Buffer A 加入1 y 1 DTT,5 y 1 PMSF,10 y 1蛋白酶抑制剂),最大转速祸旋剧烈振荡15s,放置冰上 15min;
[0化4] 5)加入11 y 1冷Buffer B,最大转速祸旋剧烈振荡5s,放置冰上Imin ;
[0055] 6)再次最大转速祸旋剧烈振荡5S后,4°C离屯、,16000Xg,5min ;
[0化6] 7)尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离屯、管,置于冰上,即得胞质蛋白;
[0化7] 8)在离屯、沉淀物(细胞核)中加入100y1预冷的BufferC(使用前每血Buffer C加入1y1DTT,5y1PMSF,10y1蛋白酶抑制剂),最大转速祸旋剧烈振荡15S,放置冰上 40min,每间隔lOmin祸旋剧烈振荡15S;
[0化引 9) 4°C离心16000Xg,lOmi
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