多肽化合物、多肽化合物与siRNA的组装体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多肤化合物，多肤化合物与siRNA的组装体，及其在基因治疗领 域的应用。
【背景技术】
[0002] 在过去的十年中，我们见证了RNA分子在基因表达调控领域中角色的理解方面取 得的巨大进步。该一进步的主要贡献是RNA干扰（RNAI)的发现。其首次由Fire和Mello在 线虫里提取，是一种通过短链RNA带来序列特异性、转录后基因沉默的进化保守机制。RNA 干扰是一种由21-23个核巧酸组成的双链小分子干扰RNA(SiRNA)介导的、序列特异性的、 转录后基因沉默技术。由于RNA干扰技术能高效、特异的沉默疾病相关基因，使其已逐渐被 发展成为新型的治疗遗传性或获得性疾病包括病毒感染和癌症等的基因治疗手段，到目前 为止已经开展了大量利用SiRNA进行疾病治疗的动物实验和临床实验。
[0003] 虽然SiRNA在体外应用研究中及细胞水平上显示出良好的沉默效果，但由于其巨 大的分子量及自身所携带的大量负电荷使其不能自主穿越细胞膜进入细胞发挥作用，在系 统运输时易引起非特异性的脱祀效应和免疫应答，同时还面临被核酸酶降解等障碍，导致 在W治疗人类疾病为目的的SiRNA体内系统运输面临着巨大的挑战。所WSiRNA的转染问 题成为限制其应用的主要瓶颈。如何增强SiRNA穿透细胞膜的能力，提高其在体内的稳定 性和祀向性等都是SiRNA药物载体急需解决的问题。因此设计和合成安全有效的SiRNA药 物载体已成为目前SiRNA药物研发的重要方向。糖、核巧W及SiRNA主链上磯酸醋的化学 修饰，已经被用于抑制核酸酶，消除对沉默效率的干扰。疏水基团的结合也有加强细胞吸收 的作用。
[0004]与化学修饰的核酸相比，载体介导方法制定核酸疗法并保护其不被降解，显得简 单快速。该些载体，包括病毒载体和非病毒载体，它们与SiRNA共组装或者共价结合。该些 载体可W加强细胞祀向，延长药物流通时间，提高膜的穿透性。病毒载体因潜在的安全性问 题及高成本等缺点使其广泛的临床应用受到极大的限制。常见的非病毒基因药物的传递载 体往往为带有正电的阳离子化合物，包括聚阳离子、正电磯脂、壳聚糖、白蛋白、树枝状大分 子W及多肤等，它们通过带正电的基团中和DNA/RNA上的负电磯酸基团，从而将基因压缩 保护成组装体颗粒，使得基因能够顺利通过各种障碍，诸如逃逸免疫系统、穿透细胞膜、从 内含体释放等等，而完成基因传递。虽然DNA或RNA组装体的结构W及性质与转染效率之 间明晰的决定关系还存在争议，但是有很多经验性的条件决定了组装体的生物相容性W及 传递DNA或RNA的效率。虽然DNA或RNA复合物的结构W及性质与转染效率之间明晰的决 定关系还存在争议，但是有很多经验性的条件决定了复合物的生物相容性W及传递DNA或 RNA的效率。单纯简单的混合方式和仅仅利用静电作用形成的DNA/RNA载体体系很不稳定， 因此设计更稳定、尺寸大小合适的载体体系是基因药物取得好的疗效的先决条件。
[0005] 多肤作为生物分子的一种，在作为基因载体上具有很多合成高分子不具备的优 势；多肤有20种性质各异的氨基酸可W组成性质丰富的一级序列；
[0006] 通过设计可W拿到beta折叠或者alpha螺旋等二级结构；通过固相合成可W拿 到纯度高、分布单一、结构明确的分子；可W很方便的改性或者连入生物可识别功能的祀向 序列提高专一性。多肤已经被用于合成药物、小分子、生物活性肤、治疗性蛋白的传递，但 是核酸机理尚未完全清楚。该些肤可W包括源于蛋白质的生物穿膜肤（cellpenetrating peptide,CP巧，阳离子肤，设计出的多肤化合物，融合肤，细胞碑1向肤（celltargeting peptides,CTP)W及包含核定位信号的肤（Nuclearlocalizationsi即aLM^S)等。阳离 子肤富含氨基酸，可W与小的核酸或者浓缩的核酸相互作用形成稳定的小颗粒。生物穿膜 肤可W促进组装体通过细胞膜。富含组氨酸对抑敏感的或者膜融合的肤可W加强内涵体 逃逸能力和基因组装体向细胞质的释放。基因传递系统中所包含的细胞祀向肤可W介导细 胞或者组织特异性祀向。核定位细胞肤的连接可W提高基因组装体的核定位能力。
[0007] 尽管针对siRNA药物运输载体的研究取得了一定的突破和发展，但要使siRNA药 物成功用于治疗人类疾病，仍有一些关键性问题需要解决，如：毒性、特异性、祀向性、免疫 刺激、转染效率低等。由此，生物相容性好、能快速去质子化的可生物降解的双性的多肤载 体因能有效结合和保护SiRNA分子，增强细胞对SiRNA分子的吸收，提高其稳定性和祀向 性，并能使SiRNA分子有效释放，实现治疗目的，而使得该类载体在SiRNA药物给药中具有 更好的优势和应用前景。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种多肤化合物，并能用其与SiRNA形成可W进行基因传递 的组装体。
[0009]为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下；一种多肤化合物，所述多肤 化合物包括疏水部分和亲水部分，所述亲水部分由带有正电的氨基酸残基组成。
[0010] 优选地，所述多肤化合物包含的氨基酸残基总数目范围为8-50。
[00川 优选地，所述多肤化合物具有通式；GLWHxAWLWHyAFLASHz化L化LR，1《X《5， l《y《5，l《z《6，x、y、z为整数。
[0012] 优选地，所述多肤化合物氮端己醜化，碳端醜胺化。
[0013] 优选地，所述多肤化合物具有通式；CH3(CH2)ieC0NH-B-C0NH2,所述B为氨基酸序 列。
[0014] 优选地，所述B具有通式；GLWHxAWLWHyAFLASHz化L化LR，l《x《5，l《y《5， 1《Z《6, X、y、Z为整数。
[00巧]优选地，所述B具有通式；HaKbVe，3《a《8,3《b《8,6《C《8,a、b、C为整 数。
[0016] 优选地，所述B具有通式；HdRe，8《d《30,8《e《20,d、e为整数。
[0017]优选地，所述B为：RLWRLLWRLWRRLWRLLR。
[0018]优选地，所述B为；RLWHLLWRLWRRLHRLLR。
[0019] 本发明还提供了一种组装体，所述组装体包括货物分子和W上所述的多肤化合 物。
[0020] 优选地，所述货物分子与所述多肤化合物通过非共价键连接组装。
[0021] 优选地，所述组装体颗粒粒径尺寸范围为20nm-999nm。
[0022] 优选地，所述核酸为siRNA。
[002引优选地，多肤化合物与siRNA的摩尔比范围为1:1-80:1。
[0024] 优选地，多肤化合物与siRNA的摩尔比为20:1。
[002引优选地，多肤化合物与SiRNA的摩尔比为40:1。
[002引优选地，多肤化合物与siRNA的摩尔比为60:1。
[0027] 本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含W上所述的组装体。
[0028] 本发明还提供了一种给病人递送药物的试剂盒，所述试剂盒包括上述的药物组合 物、一种或者多种电解质、缓冲液、递送装置W及适合把一种或者多种其他药剂混合到一起 的容器。
[0029] 本发明还提供了一种多肤化合物在向细胞或者组织传递SiRNA上的应用。
[0030] 优选地，所述细胞为卵巢细胞。
[0031] 优选地，所述细胞为肿瘤细胞或者所述组织为肿瘤组织。
[0032] 本方案的有益效果是；本发明提供的多肤化合物可W与SiRNA非共价连接，简便 的形成纳米形态的多肤化合物/siRNA组装体。本发明所设计的多肤化合物同时具有亲水 和疏水的性质，通过与细胞膜的双分子层的亲水部和疏水部作用，有效加强了 SiRNA往细 胞的传递W及在细胞内部的释放，提高了 SiRNA对细胞祀点介导的基因沉默效率。
【附图说明】
[003引图1为化5/siRNA组装体在中国仓鼠卵巢细胞的沉默效率，GL5和SiRNA的摩尔 比率 20/1、40/1，siRNA浓度 50nM。
[0034] 图2为STR-KV/siRNA组装体在中国仓鼠卵巢细胞的沉默效率，STR-KV和SiRNA的 摩尔比率分别为30/U40/1和60/1，siRNA浓度50nM。
[00；3日]图3为STR-HR/siRNA组装体在中国仓鼠卵巢细胞的沉默效率，STR-HR和SiRNA的 摩尔比率分别为30/1、45/1、60/1，siRNA浓度lOOnM。
[0036] 图4为STR-C6Ml/siRNAandSTR-C6M3/siRNA组装体在中国仓鼠卵巢细胞的沉默 效率，STR-C6M1或者STR-C6M3,和siRNA的摩尔比率分别为40/1和60/1，siRNA浓度50nM。
[0037] 图5为化5/siRNA组装体在中国仓鼠卵巢细胞中的毒性测试结果，GL5和SiRNA的 摩尔比率为分别20/1、40/1，siRNA浓度50nM。
[003引图6为STR-KV/siRNA组装体在中国仓鼠卵巢细胞中的毒性测试结果，STR-KV和siRNA的摩尔比率为分别30/1、45/1、60/1，siRNA浓度50nM。
[0039] 图7为STR-HR/siRNA组装体在中国仓鼠卵巢细胞中的毒性测试结果，STR-皿和 siRNA的摩尔比率为分别 30/1、45/1、60/1，siRNA浓度lOOnM。
[0040] 图8为STR-C6Ml/siRNAandSTR-C6M3/siRNA组装体在中国仓鼠卵巢细胞中的毒 性测试结果，STR-C6M1或者STR-C6M3,和siRNA的摩尔比率为分别40/1、60/1，siRNA浓度 50nM。
【具体实施方式】
[0041] 下面通过实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果，但不W任何方式限制 本发明的范围。
[0042] 本发明提供了一种多肤化合物，其包括疏水部分和亲水部分，亲水部分包括带有 正电的氨基酸残基。疏水部分包括疏水性氨基酸残基或硬脂酸或硬脂酸与疏水性氨基酸残 基。疏水氨基酸残