一种调控植物开花的棉花WRKY转录因子GarWRKY9及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物基因工程技术领域，是一种调控植物开花的棉花转录因子 GarWRKY9〇
【背景技术】
[0002] 开花是植物从营养生长向生殖生长转变的重要过程，是一个重要的农艺性状，它 决定该作物是否适应于特定的栽培地区及生长季节。植物开花是植物从营养生长到生殖生 长转折的关键，具有很强的可塑性。在各种外界环境和内部因子的影响下，植物会选择在 适当的时机开花进而获得生殖的成功通过调节开花期，使植物延迟或提前开花，可W控制 植物的营养生长或生殖生长，避免冷害或其它逆境对作物的伤害，同时可W有效地利用上 地资源，进行合理的轮作。在最适合的时期开花可W达到最大的效益，促进资源的积累、分 配及有效利用，对提高作物产量意义重大。
[0003] 在长期的进化过程中，植物形成了一套完整的机制，用于调节自身的生长发育W 适应或抵御外界生物和非生物胁迫，在该些进程中转录因子（W服￥、0368、臟(：、1祁等）发 挥了重要的调控作用。WRKY转录因子家族是近十几年来发现的一类植物特有的转录因子， 它们在植物体内是非组成型表达的，受生物及非生物胁迫（水杨酸、病原诱导子、高盐、干 旱、低温等）诱导，主要参与生物与非生物胁迫应答和植物衰老，有关对植物发育的调控 研究报道很少，仅见参与调控了种子和表皮毛的发育。迄今为止，鲜少见它们参与调控植 物开花的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种调控植物开花的棉花WRKY转录因子基因GarWRKY9,所述基因 cDNA核巧酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0005] 所述的调控植物耐盐性的棉花GarWRKY9基因编码的蛋白质，具有序列表中SEQ ID NO. 3所述的氨基酸序列。
[0006] 本发明提供了含有上述棉花WRKY转录因子GarWRKY9的植物 表达载体PCAMBIA2301。 将GarWRKY9基因克隆到pCAMBIA2301，获得 pCAMBIA2301-CaMV35S-GarW服Y9。
[0007] 本发明所述基因GarWRKY9在培育早花植物中的应用。具体是将GarWRKY9基因通 过植物表达载体转入目的植物内。所述植物优选是模式植物拟南芥。
[0008] 本发明的有益效果；利用现有的植物基因工程技术，利用电子克隆及RT-PCR技 术，分离与鉴定棉花开花相关基因序列信息，并通过根癌农杆菌浸花法将基因转入拟南芥， 鉴定证明转基因植株的抽臺及开花时间明显早于野生型（图6)，说明GarW服Y9基因对植物 提早开花有一定的影响。
【附图说明】
[0009] 图IGarW服Y9基因全长cDNA序列的扩增结果。
[0010] 图2RT-PCR分析不同组织器官中GarWRKY9基因的表达情况 [00川 图3植物表达载体pCAMBIA2301-CaMV35S-GarW服Y9的构建
[0012] (a)大肠杆菌 pCAMBIA2301-CaMV35S-GarW服Y 9PCR 检测电泳结果
[0013] 化)pCAMBIA2301-CaMV35S-GarW服Y9 的酶切鉴定。
[0014] 图4转基因植株的PCR鉴定
[00巧]PCR扩增载体pCAMBIA2301-CaMV35S-GarW服Y9抗性拟南芥目的基因。
[0016] 图5转基因植株的RT-PCR鉴定
[0017] 目的基因在转基因拟南芥中的表达情况。
[0018] 图6转基因拟南芥及野生型对照开花时期对照
[0019] 转基因植株比野生型提早开花。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1、GarWRKY9基因的获得
[002U 1. 1RNA 的提取
[0022]提取 RNA
[002引 （1)取0. 5g新鲜棉花组织，加入0.1 g交联聚己締祗咯烧酬（PVPP)，在液氮中充分 研磨至粉末，将冻粉末迅速转入10ml离屯、管中，加5ml CTAB提取液与500 y L0. 1M P服.0 的Tris-HCl，65°C水浴20min，中途翻转混匀；
[0024] 似加等体积氯仿充分混匀，冰浴静置lOmin ;
[00巧](3) 4°C，10000;rpm 离屯、20min。分装于 4 个 1. 5ml 离屯、管；
[0026] (4)吸上清，加入1/3体积的8M LiCl混匀，-70°C 30min或-20°C过夜；
[0027] 巧)4°C，10000巧m离屯、20min。弃上清，70 %己醇洗漆两次后，吹干沉淀溶解于 30 y L DEPC 水；
[0028] (6)加入 10U 无 RNase 活性的 0化36 和 25U RNase Inh油itor，lOXbuffer 消化 30min后加等体积氯仿，抽提一次；
[0029] (7)上清转移到新管中，加1/10体积的3M pH 5. 2NaAc和等体积的异丙醇或2. 5 倍体积的无水己醇，-20°C放置过夜或-70°C冰浴化；
[0030] 巧)41：，10000巧111离屯、20111111，弃上清，70%己醇洗漆两次后溶解于30^106口0 水。即得棉花RNA。
[0031] 1. 2 cDNA 的合成
[0032] 体系：
[003引 cDNA第一链的合成
[0034]
【主权项】
1. 一种调控植物开花的棉花转录因子GaWRKY9,其特征在于它的序列如SEQIDNo. 2 所示。
2. 权利要求1所述的调控植物开花的棉花转录因子GarWRKY9编码的蛋白质，其特征在 于它的氨基酸序列如SEQIDNo. 3所示。
3. 含有权利要求1所述的调控植物开花的棉花转录因子GarWRKY9的表达载体。
4. 根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，是pCAMBIA2301-CaMV35S-GarWRKY9。
5. 权利要求1所述的调控植物开花的棉花转录因子GarWRKY9在培育早花植物中的应 用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，是将GarWRKY9基因通过植物表达载体转 入目的植物内。
【专利摘要】本发明公开了一种棉花开花相关转录因子，即棉属野生种旱地棉WRKY基因GarWRKY9，具有序列表中SEQ ID N0.2的序列。本发明利用电子克隆及RT-PCR技术分离了一个棉花开花相关蛋白GarWRKY9，通过转化拟南芥进行功能验证，证明所述该转录因子能够使植物提早开花。
【IPC分类】C12N15-29, C12N15-84, A01H5-00, C07K14-415
【公开号】CN104725496
【申请号】CN201510156001
【发明人】郭琪, 沈新莲, 范昕琦, 徐鹏, 张香桂
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年4月2日