一种类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白及其制备方法和应用

文档序号:8406523阅读:657来源:国知局
一种类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术研究领域,具体设及一种类弹性蛋白多肤与柯萨奇腺病毒受 体融合蛋白的制备方法及其在重组腺病毒浓缩和纯化中的应用。 技术背景
[0002] 作为基因转移载体,腺病毒与其他病毒相比具有许多优点,包括容易制备高滴度 的重组病毒、能转导多种分裂和静止期细胞、基因导入效率高、外源基因能有效表达和插入 宿主基因组引起突变的风险小等,因此重组腺病毒在人和动物基因治疗和基因工程疫苗研 究中已得到广泛应用。
[0003] 重组腺病毒的广泛使用需要快速、经济、大量制备高质量的重组病毒,现有的重组 腺病毒浓缩与纯化方法主要有化学沉淀法、超速离屯、法和层析法。其中,聚己二醇沉淀法是 经典的重组病毒浓缩方法,但需要离屯、大量的细胞培养液;硫酸锭沉淀法兼有浓缩和纯化 重组腺病毒的作用,但通常需与其他纯化方法相结合才能达到纯化目的;氯化飽密度梯度 离屯、法是制备高质量重组腺病毒的经典方法,但因难W规模化而不能满足临床应用需要; 虽然许多层析法也可用于重组腺病毒的纯化,但该些方法最初为纯化蛋白而设计,纯化重 组腺病毒的效果往往不佳。另外,上述重组腺病毒浓缩与纯化方法都有费力、费时、成本高 和需要专口设备等缺点。
[0004] 腺病毒W受体参与的胞吞机制进入祀细胞。参与不同血清型腺病毒感染的受体有 多个,其中柯萨奇腺病毒受体(Coxsackievirusandadenovirusrec巧tor,CAR)是柯萨奇 病毒BW及人腺病毒血清型2和5的高亲和力吸附受体,而目前用于人和动物基因工程疫 苗的重组腺病毒多为血清2和5型。CAR是一种46kDa跨膜糖蛋白,由胞外区、跨膜区和胞 浆内尾部=部分组成。其中,胞外区由D1和D2两个免疫球蛋白样结构域组成,两者之间为 间隔序列。现有的研究资料显示,重组大肠杆菌表达的CAR-D1区即可与腺病毒结合,提示 可W作为捕捉和浓缩腺病毒的诱巧蛋白。
[0005] 类弹性蛋白多肤巧lastin-1化epolyp巧tide,ELP)是根据弹性蛋白相关序列合 成的五肤(鄉氨酸-脯氨酸-甘氨酸-任何氨基酸-甘氨酸)聚合物,具有温度敏感的可 逆相变特性,在低于相变温度溶液中呈溶解状态,在高于相变温度溶液中呈凝聚状态,因此 可用简单的离屯、或过滤法与细胞蛋白分离。已经表达的ELP融合蛋白能保持ELP的可逆相 变特性,因此ELP已被用作纯化重组蛋白的标签蛋白,但ELP与腺病毒受体的融合蛋白能否 保持可逆相变特性,并进一步用于重组腺病毒的浓缩与纯化,尚有待研究。
[0006] 本发明将ELP的温度敏感相变特性与腺病毒受体的结合特异性相结合,将重组大 肠杆菌表达的ELP与CAR-D1融合蛋白巧LP-CAR)用于重组腺病毒的浓缩与纯化。尽管该 种策略是容易想到的,但在具体设计时却面临W下技术问题;天然CAR-D1序列是否适合 在大肠杆菌中高水平表达、CAR-D1区与ELP融合后能否正确折叠、在什么条件下ELP-CAR 融合蛋白能保持溶解状态、如何洗脱释放与ELP-CAR融合蛋白结合的腺病毒并不被灭活、 结合融合蛋白的腺病毒是否能感染敏感细胞。为此,本发明在已知ELP序列能在重组大肠 杆菌中有效表达基础上,将CAR-D1区序列优化成大肠杆菌偏爱密码子序列,W便两者融合 蛋白能在重组大肠杆菌中高水平表达;利用CAR蛋白两个胞外区之间的间隔序列作为ELP 与CAR-D1区的弹性间隔序列,W便CAR-D1区能在融合蛋白表面自由折叠和展示;在测得 ELP-CAR融合蛋白相变温度基础上,在低于相变温度下进行融合蛋白表达和与腺病毒结合, W确保其可溶性;通过对腺病毒洗脱条件的系统优化,使腺病毒能从融合蛋白上有效洗脱 并不被灭活。与现有的其他方法相比,用本发明的ELP-CAR融合蛋白不仅能从感染细胞中 浓缩和纯化重组腺病毒,而且能从水等环境样品中浓缩人和动物腺病毒,纯化的重组腺病 毒不仅可用于动物实验研究,还可作为基因工程疫苗。

【发明内容】

[0007] 为了解决现有技术存在的问题,本发明提供了一种类弹性蛋白多肤巧L巧与柯萨 奇腺病毒觉体(CAR)融合蛋白及其制备方法和应用。
[000引本发明的类弹性蛋白多肤与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白,由ELP、间隔区和CARD1 区组成。经病毒纯化试验证明,利用该融合蛋白能从重组腺病毒感染细胞及其培养上清中 有效浓缩与纯化重组腺病毒。
[0009] 本发明所述融合蛋白用下列方法制备:
[0010] (1)依次将ELP、间隔区和CA畑1区编码序列插入原核表达载体祀T-30a,获得重组 载体祀T-ELP-CAR;
[0011] (2)用重组载体祀T-ELP-CAR转化大肠杆菌,在20°C条件下进行ELP-CAR融合蛋 白诱导表达;
[0012] (3)用1. 5M氯化钢和26 °C离屯、沉淀ELP-CAR融合蛋白。
[0013] 其中步骤(1)是;CARD1编码序列为利用生物信息学软件优化和化学合成的大肠 杆菌偏爱密码子序列,W便在重组大肠杆菌中高水平表达;用CAR蛋白两个胞外区之间的 间隔序列作为CARD1与ELP之间的弹性间隔序列,W便CARD1在融合蛋白上自由折叠和展 /J、- 〇
[0014] 本发明还公开了所述的ELP-CAR融合蛋白在重组腺病毒浓缩和纯化中的应用,其 具体方法如下:
[0015] (1)将120yg/mlELP-CAR融合蛋白与重组腺病毒感染细胞裂解物或培养上清混 合;
[0016] (2)用确1. 5M氯化钢和26°C离屯、沉淀重组腺病毒;
[0017] (3)用pH9. 0缓冲液洗脱重组腺病毒;
[0018] (4)用1. 5M氯化钢和26°C离屯、去除ELP-CAR融合蛋白。
[0019] 进一步地,公开了上述融合蛋白在浓缩与纯化表达绿色巧光蛋白重组腺病毒中的 应用。本发明采用了W下方法对融合蛋白进行验证:
[0020] (1)用聚合酶链式反应(PCR)扩增绿色巧光蛋白(GFP)编码序列,插入腺病毒载体 P化uttle-CMV,获得重组载体pShuttle-GFP;
[0021] (2)按照常规方法用AAV-293细胞制备重组腺病毒rAd-GFP;
[0022] (3)将120yg/mlELP-CAR融合蛋白与重组腺病毒感染细胞裂解物或培养上清混 合;
[0023] (5)用1. 5M氯化钢和26°C离屯、沉淀重组腺病毒;
[0024] (6)用pH9. 0缓冲液洗脱重组腺病毒;
[0025] (7)用1. 5M氯化钢和26°C离屯、去除ELP-CAR融合蛋白。
[0026] 与现有的其他方法相比,用本发明的类弹性蛋白多肤与柯萨奇腺病毒受体融合蛋 白浓缩和纯化重组腺病毒具有简单、快速和经济等优点,制备的重组腺病毒可W用于动物 实验研究和基因工程疫苗。
【附图说明】:
[0027] 图1ELP-CAR融合表达载体的结构示意图。PT7为T7启动子,ELP为类弹性蛋白多 肤编码序列,Spacer为CARD1与D2结构域间隔序列,CARD1为CARD1结构域编码序列。
[002引图2ELP-CAR融合蛋白的表达与纯化及电泳分析。1是空载体转化菌裂解液,2为IPTG诱导祀T-ELP-CAR重组菌裂解液离屯、上清,3为IPTG诱导祀T-ELP-CAR重组菌裂解液 离屯、沉淀,4为第一轮相变循环后的ELP-CAR,5为第二轮相变循环后的ELP-CAR。
[0029] 图3ELP-CAR融合蛋白的免疫转印鉴定。1为His-ELP融合蛋白,2为ELP-CAR融 合蛋白。
[0030] 图4ELP-CAR融合蛋白与重组腺病毒的吸附。1为rAd-GFP阳性对照,2为His-ELP 融合蛋白与rAd-GFP结合的罔心扣紅,3为His-ELP融合蛋白与rAd-GFP结合的罔心上清, 4为ELP-CAR融合蛋白与rAd-GFP结合的离屯、沉淀,3为ELP-CAR融合蛋白与rAd-GFP结合 的离屯、上清。
[0031] 图5重组腺病毒的洗脱。横坐标为洗脱时间,纵坐标为洗脱重组腺病毒的病毒回 收率。
[0032] 图6纯化重组腺病毒感染细胞的巧光显微镜观察。PK-15 (CAR+)表示CAR表达阳性 猪肾PK-15细胞,CH〇-Kl(CARi?)表示CAR低水平表达仓鼠卵巢细胞,NIH3T3(CAIT)为CAR 表达阴性小鼠胚胎成纤维细胞,rAd-GFP表示洗脱重组腺病毒感染细胞,ELP-CAR/rAd-GFP 表示未洗脱重组腺病毒感染细胞。
[0033] 图7纯化重组腺病毒的细胞感染效率。横坐标为用于感染的洗脱和未洗脱重组腺 病毒,纵坐标为感染效率,+FBS代表细胞培养液含辖牛血清,-FBS代表细胞培养液不含辖 牛血清。
[0034] 具体实施步骤
[0035] 生物材料来源;
[0036] l.pET-30a载体;从美国Novagen公司引进,本实验室保存。
[0037] 2.D册a大肠杆菌;从美国抓Biosciences Clontech公司引进,本实验室保存。
[003引 3.
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