一株酿酒酵母及其在黄酒酿造中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及一株酿酒酵母及其在黄酒酿造中的应用。
【背景技术】
[0002] 发酵是用来保持和提高食物风味和营养价值最古老的方法。在我国，以谷物（南 方主要是糯米，北方主要是黍米、黑米和玉米）为原料，经麦曲和酒母经糖化和发酵制成的 黄酒，作为我国最古老的酒种，与啤酒、葡萄酒一起并称为世界三大古酒。黄酒的发酵是利 用酒药和麦曲等所含有的多种微生物，进行开放式的"双边发酵"，将原料中的淀粉糖化。酵 母利用糖生成的酒精，蛋白质和脂肪等成分经微生物作用后变成了有机酸、氨基酸、酯及杂 醇油，使得黄酒富含丰富的营养物质，因此，素有"液体蛋糕"的美称。
[0003] 黄酒酿造过程中，酵母作为关键微生物，是发酵重要的动力源，优良的酵母菌种是 酿制高产优质黄酒的前提。酵母菌不仅对发酵醪内的糖进行分解或同化淀粉和糊精，产生 乙醇，同时，酵母发酵性能的优劣，代谢产物的差异直接影响到黄酒的风味、口感和出酒率。
[0004] 在所有酿制酒中，要数黄酒的酒精含量（14-20% )最高，比起葡萄酒的8% -18% 和啤酒的3% -6%都高，同时酿造过程中发酵液存在高渗透压、高盐、高酸等不利环境。酵 母抵御不良环境的能力对于黄酒发酵过程的顺利进行和生产效率的高低密切相关。为避免 发酵过程发生阻遏或迟滞现象，要求酵母菌种须具备足够的胁迫应答能力来抵御其所造 成的影响。因此筛选出起酵速度快、产酒能力强、优良发酵性能，同时耐高渗透压、耐高酒精 以及耐酸的抗逆性优良的酵母菌株作为理想的发酵剂用于优质黄酒的酿造生产，对于黄酒 发酵工业具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明为解决上述问题而进行的，针对现有技术中缺乏抗逆性优良、发酵效率高 的黄酒酿酒酵母的不足，提供一株抗逆性优良、发酵效率高的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)及其在黄酒酿造中的应用。
[0006] 本发明采用了如下技术方案：
[0007] 本发明提供了一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株，已保藏于中 国普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCC NO. 9445。
[0008] 进一步的，本发明提供了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株的筛选 方法，具有这样的特征，包括以下步骤：步骤一，采用浓度梯度稀释法稀释黄酒酿造主液，取 稀释液IOOuL涂布于培养基平板上，而后进行划线分离纯化，得到分离菌株；步骤二，将步 骤一中的分离菌株，采用TTC显色平板、杜氏管发酵、C02失重法进行初步筛选，得到初步筛 选菌株；步骤三，将步骤二中的初步筛选菌株通过酒精耐受性、乳酸耐受性以及高渗耐受性 实验进行复筛，得到BR20菌株。
[0009] 本发明提供的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株的筛选方法，还可 以具有这样的特征：步骤一中的培养基平板为Yro培养基平板。
[0010] 本发明提供的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株的筛选方法，还可 以具有这样的特征：BR20菌株通过18SrDNA序列对比分析，确定种属。
[0011] 进一步的，本发明还提供了利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BR20菌 株进行黄酒酿造的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，将BR20菌株从斜面上转接 并进行预活化，得到预定浓度的接种液；步骤二，向灭过菌的容器中投入发酵原料米饭，并 向发酵原料米饭中接入5-15% (v/v)的所述接种液以及加入2%-20% (v/v)的麦曲，在 20-35°C条件下静置开始进行主发酵；步骤三，步骤二中的主发酵进行10-30天后，将发酵 醪液进行过滤压榨，得到的滤液进行过夜澄清后得到黄酒。
[0012] 本发明还提供的利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株进行黄酒 酿造的方法，还可以具有这样的特征：步骤一中的菌株的预活化方法为：将BR20菌株接种 于麦芽汁培养基上，在培养温度为30°C的条件下振荡培养16h，得到一级种子液，一级种子 液以同样的条件进行二次扩大培养，得到二级种子液，二级种子液以4000rpm的条件离心 8min后，收集菌体，菌体用生理盐水悬浮，得到菌体浓度为108cfu/mL的接种液。
[0013] 本发明还提供的利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株进行黄 酒酿造的方法，还可以具有这样的特征：发酵原料米饭的制备方法为：将从市面上购得的 糯米洗净后加入水进行浸米，待浸米水酸度达到2-10g/L，结束浸米，而后常压条件下蒸煮 20min〇
[0014] 发明作用与效果
[0015] 本发明提供了一株抗逆性优良、发酵效率高的酿酒酵母（Saccharomyces Cer eviSiae)BR20菌株，从传统的黄酒酿造主液筛选得到，可耐受高达18% vol酒精浓度 的发酵环境，在I. 6mol/L的氯化钠浓度的高渗透压条件下有较好的适应性，在54g/L的 乳酸浓度下仍有较好的生长状况；利用该菌株进行黄酒酿造，可以使酵液酒精含量达到 30. 58g/100mL，同时具有良好的风味及营养。
【附图说明】
[0016] 图1是本发明的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)BR20的生长曲线。
【具体实施方式】
[0017] 以下结合附图来说明本发明的【具体实施方式】。对于实施例中所用到的具体方法或 材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换 选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
[0018] 实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂 等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0019] Yro培养基：10g酵母浸粉，20g蛋白胨，20g葡萄糖，加水至1000mL，2%琼脂， 121°C高压灭菌20min，冷却后备用。
[0020] 麦芽汁培养基：取200g麦芽，分别加入0.6g的1%。糖化酶与液化酶，加水至 1000 mL，在55-65 °C条件下糖化3-4h，调整糖度为12-15 ° Bx，2 %琼脂，121 °C高压灭菌 20min，冷却后备用。
[0021] 实施例一、酿酒酵母菌株的筛选与鉴定
[0022] I. 1样品稀释液制备及菌株分离
[0023] 采集来自浙江、上海地区传统方法酿造的黄酒主酵样品2g，加入15mL无菌水，剧 烈震荡20min。采用浓度梯度稀释法（KT 1-KT4)，取稀释液IOOuL涂布于YH)琼脂培养基平 板上，28°C静置培养48h，挑选菌落大、生长快的菌株，进一步划线分离纯化。
[0024] L 2菌株初筛
[0025] 将步骤I. 1中的菌株以点植法利用TTC显色平板、杜氏管发酵、CO2失重法进行初 步筛选。记录产气时间、最终产气量以及〇) 2总失重量，选择出四株菌株。实验结果如表1 所示：
[0026] 表1酵母菌的初筛结果
[0027]
【主权项】
1. 酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)BR20菌株，已保藏于中国普通微生物保藏 中心，保藏编号为CGMCCNO. 9445。
2. 酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)BR20菌株的筛选方法，其特征在于，包括以 下步骤： 步骤一，采用浓度梯度稀释法稀释黄酒酿造主液，取稀释液IOOuL涂布于培养基平板 上，而后进行划线分离纯化，得到分离菌株； 步骤二，将所述步骤一中的分离菌株，采用TTC显色平板、杜氏管发酵、C02失重法进行 初步筛选，得到初步筛选菌株； 步骤三，将所述步骤二中的初步筛选菌株通过酒精耐受性、乳酸耐受性以及高渗耐受 性实验进行复筛，得到所述BR20菌株。
3. 根据权利要求2所述的酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)BR20菌株的筛选方 法，其特征在于： 其中，所述步骤一中的培养基平板为Yro培养基平板。
4. 根据权利要求2所述的酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)BR20菌株的筛选方 法，其特征在于： 其中，所述BR20菌株通过18SrDNA序列对比分析，确定种属。
5. 利用酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)BR20菌株进行黄酒酿造的方法，其特 征在于，包括以下步骤： 步骤一，将BR20菌株从斜面上转接并进行预活化，得到预定浓度的接种液； 步骤二，向灭过菌的容器中投入发酵原料米饭，并向所述发酵原料米饭中接入5-15% (v/V)的所述接种液以及加入2%-20% (v/v)的麦曲，在20-35°C条件下静置，开始进行主 发酵； 步骤三，所述步骤二中的主发酵进行10-30天后，将发酵醪液进行过滤压榨，得到滤 液，将所述滤液进行过夜澄清后得到所述黄酒。
6. 根据权利要求5所述的利用酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)BR20菌株进行 黄酒酿造的方法，其特征在于： 其中，所述步骤一中的菌株的预活化方法为：将所述酿酒酵母（Saccharomyces CereviSiae)BR20菌株接种于麦芽汁培养基上，在培养温度为30°C的条件下振荡培养16h， 得到一级种子液，所述一级种子液以同样的条件进行二次扩大培养，得到二级种子液， 所述二级种子液以4000rpm的条件离心8min后，收集菌体，将所述菌体用生理盐水制 成悬浮液，得到菌体浓度为108cfu/mL的接种液。
7. 根据权利要求5所述的利用酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)BR20菌株进行 黄酒酿造的方法，其特征在于： 其中，所述发酵原料米饭的制备方法为：将糯米洗净后加入水，进行浸米，待浸米水酸 度达到2-10g/L，结束浸米，而后常压条件下蒸煮20min。
【专利摘要】本发明提供了一株抗逆性优良、发酵效率高的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株，从传统的黄酒酿造主液筛选得到，可耐受高达18％(vol)酒精浓度的发酵环境，在1.6mol/L的氯化钠浓度的高渗透压条件下有较好的适应性，在54g/L的乳酸浓度下仍有较好的生长状况；利用该菌株进行黄酒酿造，得到的黄酒中酒精含量高，还原糖含量低，底物利用较完全，产品具有独特风味，口感及较高的营养。CGMCC NO.944520140711
【IPC分类】C12N1-16, C12G3-02, C12R1-865
【公开号】CN104726352
【申请号】CN201510031501
【发明人】艾连中, 杨昳津, 夏永军, 王光强, 俞剑燊, 方逸群
【申请人】上海理工大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年1月22日