一种大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体的构建及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种大肠杆菌与乳酸杆菌之间的穿梭 载体制备方法及应用穿梭载体表达乳酸菌素，本发明的穿梭载体可用于在乳酸杆菌中进行 蛋白的表达应用。
【背景技术】
[0002] 食品在加工、贮藏、运输等过程中，易受到有害微生物的污染而导致腐败变质或食 物中毒的发生，采用添加防腐剂来抑制微生物的生长，是防止食品腐败变质的重要手段。研 宄表明，一些化学防腐剂有致癌性、致畸性和引起食物中毒现象发生，对人体健康影响较 大，它的应用越来越受到众多国家的限制。而生物防腐剂是近年来发现的一类新型的天然 防腐剂，具有无毒、安全、性能稳定、适用性广等优点。
[0003] 乳酸菌素是某些乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌 生物活性的肽或前体，对革兰氏阳性菌具有较好的选择性抑制生长能力，而且对热及酸碱 稳定性较好，可被人体蛋白酶降解等特点，因此乳酸菌素是天然安全的生物防腐剂。自1969 年英国食品防腐剂委员会和世界卫生组织联合食品添加剂专家委员会确认Nisin(乳酸链 球菌素）为食品防腐剂以来，Nisin作为第一个应用于食品中的乳酸菌素，以其生产基因稳 定、抑菌范围较广、食用安全而陆续被许多国家所接受。
[0004] 在众多的乳酸菌素中，II a类乳酸菌素因其良好的稳定性和高效的抑菌活性引起 了人们的关注。研宄表明，而II a类乳酸菌素大多属于质粒编码，质粒的拷贝数及稳定性 决定了乳酸菌素的产量。因此，筛选高拷贝，稳定性好的乳酸菌天然质粒是提高乳酸菌产量 的关键。
[0005] 本发明的目的利用从植物乳杆菌中分离得到的内源性质粒pZL3为骨架，以来源 于原核表达载体pET30a(+)的大肠杆菌复制子ori和卡那霉素抗性表达盒kan，构建一种能 够在大肠杆菌和乳酸杆菌中进行稳定遗传的穿梭载体。并且，利用制备的穿梭载体在干酪 乳酸菌中表达乳酸菌素。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供一株具有抗单核细胞增生李斯特菌活性，含有天然质 粒的植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL。
[0007] 本发明所提供的植物乳杆菌植物亚种是：植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum)Zhang_LL，已于2012年12月4日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC)，保藏号为：CGMCC No. 6936。保藏地址：北京 市朝阳区大屯路中国科学院微生物研宄所。
[0008] 上述具有抗单增李斯特菌活性，含天然质粒的植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL属 于本发明保护范围。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体的构建及应用方 法。
[0010] 申请人构建得到一种大肠杆菌与乳酸杆菌穿梭载体PZLT3,它是通过如下步骤获 得的：
[0011] (1)以保藏号为CGMCC No. 6936的植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum) Zhang-LL中的内源性天然质粒pZL3为骨架，其核苷酸序列 如序列表SEQ ID NO :1(已经提交Genebank !KJ767737)。采用限制性内切酶KpnI和NcoI 进行双酶切后，回收酶切后的质粒大片段。
[0012] (2)以载体pET30a⑴为模板，进行一次PCR扩增，得到含有质粒复制起始点的 DNA片段ori和卡那霉素抗性基因表达盒kan，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :2。采用 限制性内切酶KpnI和NcoI将PCR产物进行双酶切后，回收酶切后的PCR产物。
[0013] (3)将步骤（1)和步骤（2)得到的片段采用T4DNA连接酶进行连接，并将连接产物 转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，挑取转化子，提取质粒，对质粒进行酶切鉴定，得到穿梭 载体PZLT3,其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:3所示。
[0014] 应用构建的大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体pZLT3转化干酪乳杆菌KL1，表达乳酸 菌细菌素，方法如下：
[0015] (1)挑取新鲜培养的干酪乳杆菌KLl单菌落，接种于5mL MRS液体养基中，37°C静 止培养12h。
[0016] (2)按1 : 20的比例接种到MRS培养液中，37°C继续培养至0D600为0· 6左右； 将培养液转移到预冷的500mL离心管中，冰上放置IOmin ;4°C 5, 000r/m离心5min，用50mL 冰冷的 EPWB 缓冲液（6mmol/L NaH2P04(pH8. 0)，lmmol/L MgCl2)洗涤 3 次；用 50mL 冰冷的 EPB 溶液（6mmol/L NaH2P04(pH8. 0)，lmmol/L MgCl2,0. 2mol/L鹿糖）洗绦一次，用适量冰冷 的EPB缓冲液悬浮，分装每管350 μ 1待用。
[0017] (3)电转化：将20 μ 1提取的重组质粒pZLT3与350 μ 1干酪乳杆菌KLl感受态细 胞轻柔混合，冰浴l〇min。将感受态细胞和连接产物的混合物转入预冷的2_电转化杯中， 2000V电击一次，之后迅速加入500 μ 1冰预冷的MRS液体培养基，37°C静止培养2h。
[0018] (4)取200 μ 1菌液涂布于含有20 μ g/mL卡那霉素的MRS琼脂培养基上，37°C培养 24h〇
[0019] (5)挑取重组载体pZLT3阳性的转化干酪乳杆菌KLl-pZLT3,接种于IOmL含有 20 μ g/mL卡那霉素的MRS液体培养基中，37 °C培养过夜，乳酸菌素表达分析。
[0020] 上述的大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体的构建及应用方法属本发明保护范围。
[0021] 更详细的技术方案及其应用参见《【具体实施方式】》。
[0022] 本发明的积极效果是：
[0023] 1.使用成熟的大肠杆菌ori家族复制子作为穿梭载体的元件之一，使得在大肠杆 菌中提取该穿梭载体时一次可获得较大量的质粒DNA，方便后续的DNA操作。
[0024] 2.将来源于植物乳杆菌的质粒复制子与大肠杆菌中的质粒复制子相结合，相比单 独使用广宿主范围的复制子，获得的穿梭载体在乳酸杆菌不同菌株的可用范围会更广泛。
[0025] 3.由于乳酸菌素的编码基因存在于天然质粒pZL3中，自身带有完整的表达元件， 包括乳酸菌素编码基因，免疫蛋白编码基因、转运蛋白编码基因等。因此，可以更好的在乳 酸菌中表达乳酸菌素蛋白。
[0026] 序列表SEQ ID NO : 1是植物乳杆菌Zhang-LL内源质粒pZL3的完整核苷酸序列。
[0027] 序列表SEQ ID NO :2是以pET30a(+)为模板，PCR扩增得到的含有质粒复制起始 点的DNA片段ori和卡那霉素抗性基因表达盒kan的核苷酸序列。
[0028] 序列表SEQ ID NO :3是构建的大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体pZLT3的核苷酸序 列。
【附图说明】
[0029] 图1为pZL3载体图谱
[0030] 图2为大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体pZLT3构建示意图
[0031] 图3为应用穿梭载体PZLT3在干酪乳杆菌KLl中表达乳酸菌素
【具体实施方式】
[0032] 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0033] 实施例1、植物乳杆菌Zhang-LL内源质粒的提取与鉴定
[0034] 1、植物乳杆菌Zhang-LL内源质粒的提取
[0035] 挑取植物乳杆菌Zhang-LL单菌落，接种于5mL的MRS培养基中，37 °C培养16h。 将菌液5, OOOrpm离心5min，弃去上清液，将菌体重悬于250 μ 1缓冲液I (20mg/mL溶菌 酶，50mM 葡萄糖，25mM Tris-Cl，10mM EDTA，pH 8.0)中，37°C放置 lh，加入 250 μ1 缓冲 液II (0. 2Ν NaOH，I % SDS)中，混匀，室温放置5min，加入350 μ 1缓冲III (3Μ醋酸钾，2Μ 醋酸），混勾，室温放置lOmin。12, OOOrpm离心10min，吸取700 μ 1上清液至一新的离心 管中，加入700 μ1酚：氯仿：异戊醇（25 : 24 : 1)溶液，剧烈震荡混匀。12,000rpm离 心10min，吸取700 μ 1上清液至一新的离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20°C放置 30min。12, OOOrpm离心10min，弃上清溶液，加入500 μ 1乙醇溶液（70% )，混勾。12, OOOrpm 离心10min，弃上清，将离心管室温放置IOmin至乙醇充分挥发，加入50 μ 1去离子水溶解质 粒，-20 °C储存待用。
[0036] 2、植物乳杆菌Zhang-LL内源质粒pZL3序列分析
[0037] 提取得到的植物乳杆菌Zhang-LL内源质粒采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检 测，切胶回收大小约为13kb的质粒pZL3。回收得到的质粒pZL3使用限制性内切酶 KpnI(NEB)进行单酶切，得到酶切的质粒。将酶切后的质粒pZL3与同样经过KpnI (NEB) 酶切的载体pET30a(+)使用T4 DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞， 卡那霉素（lOOμg/ml)抗性筛选阳性转化子，提取质粒，对质粒进行酶切鉴定，确认重 组质粒后进行测序分析（上海生工）。序列分析结果如序列表SEQ ID NO :1，并已提交 Genebank(KJ767737);绘制载体图谱如附图1所示。
[0038] 实施例2、大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体pZLT3的构建
[0039] 穿梭载体pZLT3构建过程如附图2所示：
[0040] 1、pZL3质粒的双酶切
[0041] 质粒pZL3使用KpnI (NEB公司）和NcoI (NEB公司）进行双酶切反应，体系如下：
[0042]
【主权项】
1. 植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)Zhang_LL CGMCCNo. 6936。
2. -种大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体pZLT3的构建及应用方法，其特征在于：（1)以 保藏号为CGMCCNo. 6936的植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillusplantarumsubsp. plantarum)Zhang-LL中的内源性天然质粒pZL3为骨架，其核苷酸序列如序列表SEQID NO:1 ;采用限制性内切酶KpnI和NcoI进行双酶切后，回收酶切后的质粒大片段；（2)以载 体pET30a(+)为模板，进行一次PCR扩增，得到含有质粒复制起始点ori的DNA片段和卡那 霉素抗性基因表达盒kan，其PCR扩增得到的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:2;采用限制 性内切酶KpnI和NcoI将PCR产物进行双酶切后，回收酶切后的PCR产物；（3)将步骤（1) 和步骤（2)得到的片段采用T4DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5a感 受态细胞，挑取转化子，提取质粒，对质粒进行酶切鉴定，得到穿梭载体PZLT3,其核苷酸序 列如SEQIDNO:3所示；(4)构建的大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体pZLT3转化干酪乳杆菌 KLl，表达乳酸菌细菌素蛋白。
【专利摘要】本发明名称为一种大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体的构建及应用。本发明涉及基因工程技术领域，目的在于构建一种大肠杆菌与乳酸杆菌之间的穿梭载体，该载体被命名为pZLT3，其包含有如序列表SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。本发明的载体的突出优点在于：首次利用植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL(保藏号为：CGMCC No.6936)菌株中天然质粒pZL3为骨架，其包含有如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。构建适用于大肠杆菌和乳酸杆菌的穿梭载体，这种载体在大肠杆菌和乳酸杆菌中都具有稳定遗传的特点。同时，由于乳酸菌天然质粒pZL3中包含乳酸菌细菌素蛋白表达的编码基因及全部调控基因，构建的穿梭载体可以直接用于在乳酸杆菌中表达乳酸菌细菌素蛋白。CGMCC No.693620121204
【IPC分类】C12N1-20, C12N15-66, C12N15-74, C07K14-335
【公开号】CN104726360
【申请号】CN201410642134
【发明人】谢远红, 张红星, 刘慧 , 熊利霞, 金君华, 高秀芝
【申请人】北京农学院
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2014年11月14日