一种利用重组大肠杆菌发酵生产顺式-3-l-羟脯氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 一种利用重组大肠杆菌发酵生产顺式-3-L-羟脯氨酸的方法，属于微生物基因工 程领域。
【背景技术】
[0002] 顺式-3-L-羟脯氨酸（C3HP)作为一种稀有的环状β -羟基-α氨基酸，不仅是骨 胶原的组成成分，而且还是许多次级代谢物，如放线菌素、宜他霉素、远霉素等的组成成分。 因此，C3HP成为合成这些抗生素必不可少的基本单元。在医药方面，C3HP不仅可以直接作 为肿瘤和胶原蛋白疾病的药物，而且是合成许多药物的重要手性合成子。同时它还能用于 合成选择性雄性受体调节剂BMS-564929、碳氢霉烯类抗生素、血管紧张肽转化酶抑制剂、解 痉挛制剂等。此外它还能用于合成DNA促旋酶抑制剂，如：cyclothialidine、plusbacin和 tripropeptins。在化学合成领域，C3HP作为重要的手性分子用于合成倒千里光裂碱、流涎 胺等。在不对称合成领域，它还被直接用做有机金属催化剂。而其他的C3HP衍生物，如卡 泊芬净和Pneumocandin B0,能做为抗真菌药物使用。
[0003] 目前，生产C3HP的方法主要是化学合成法。但是化学合成法存在：（1)生产成本 高；（2)合成步骤较多；（3)分离精制工序复杂；(4)生产效率低等缺点。所以，有必要寻求 一种新型合成方法进行化学替代，以便实现C3HP大规模工业制造。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的问题是提供一种用微生物酶法生产C3HP的方法。
[0005] 与本发明有关的顺式-3-脯氨酸羟化酶结构基因（P3H)编码顺式-3-脯氨酸羟化 酶，该酶能够在2-酮戊二酸和2价铁离子存在下，使游离的L-脯氨酸羟基化生成C3HP。
[0006] 本发明通过将P3H与高效启动子组合，实现在宿主菌中大量表达该羟化酶。通过 提供所需的碳源、氮源、微量元素等，将L-脯氨酸羟基化生成C3HP。
[0007] 下面，详细地说明本发明生产C3HP的方法。
[0008] 本发明所述的重组微生物的构建方法是合成P3H，然后用限制酶类处理合成的 P3H，做成合适的DNA片段，插入到表达载体中启动子的下游，构建可大量表达顺式-3-脯 氨酸羟化酶的重组质粒，将重组质粒导入到合适的宿主微生物中，得到产C3HP的重组微生 物。载体中的启动子只要是能在宿主菌中表达的即可，可以是载体自带的启动子，如T7启 动子或者Lac Z启动子，以及大肠杆菌或噬菌体等的启动子。也可以是外源的启动子，经过 一定处理连接到表达载体上，如色氨酸串联启动子Ptrp2。
[0009] 作为表达载体可以使用任何能在宿主菌中独立进行复制或者可与宿主染色体发 生重组的载体。例如有pET系列质粒、pUC19质粒、PES质粒、pAMP质粒、pkl8mobsacB质粒 等。作为宿主，可以表达目的基因的都可以使用，例如除了大肠杆菌属，棒状杆菌属等属的 微生物菌株外，还可以使用酵母菌株等。
[0010] 顺式-3-脯氨酸羟化酶结构基因只要是编码顺式-3-脯氨酸羟化酶的基因都可以 作为目的基因使用。例如来源于链霉菌THl (Str印tomyces sp. TH1)的编码顺式-3-脯氨 酸羟化酶的基因等。为了使P3H在宿主中表达，在基因合成前首先要经过基因优化，使其更 适于在宿主中表达。以大肠杆菌为宿主，通过一些在线工具，如JCAT，优化了 P3H，然后通过 同义替换等方法消除一些在大肠杆菌中使用频率低的密码子，优化mRNA的二级结构，使得 核糖体能够顺利地沿着起始密码子向后翻译。
[0011] 对于如上所述构建的重组微生物，进行培养的培养基只要是含有宿主可以利用的 物质，并能有效对宿主进行培养的培养基，无论是天然培养基或者合成培养基皆可。例如对 于用大肠杆菌作为宿主的微生物，只要培养基中含有可以利用的碳源、氮源、无机盐等，可 以表达有活性的顺式-3-脯氨酸羟化酶的培养基都可以。
[0012] 作为碳源，只要是微生物可以利用的均可以，如常见的淀粉、淀粉水解中间物、蔗 糖、葡萄糖和半乳糖等，也可有机酸（如醋酸、丙酸）和醇类（如乙醇、甘油）。作为氮源，可 以使用各种有机酸或者无机酸的铵盐及任何含氮化合物。作为无机盐，可以使用磷酸盐、硫 酸镁和钾盐等。必要时可以添加一定的微量元素。
[0013] 微生物的培养只要氧气量、温度、pH等条件适宜即可。大部分微生物需要在震荡 或者通气搅拌等好氧条件下培养，培养温度最好在15~40°C、pH维持在3. 0~9. 0,此外， 培养时间为12~100小时。根据需要，还可向培养基中添加氨苄青霉素、卡那霉素等抗生 素。
[0014] 将培养得到的培养物、菌体或者它们的处理物作为酶源，在2-酮戊二酸和亚铁离 子存在下，于水性介质中使L-脯氨酸羟基化为C3HP，再从该水性介质中检测生成的C3HP。 或者直接往微生物培养基中加入L-脯氨酸、2-酮戊二酸和亚铁离子，从培养液中检测生成 的 C3HP。
[0015] 检测时只要能定量测定C3HP的方法即可。例如采用2, 4-二硝基氟苯（DNFB)柱前 衍生法将C3HP衍生化处理后，通过HPLC系统于360nm紫外检测波长下测定C3HP的浓度。 或者采用比色法对C3HP进行定量，检测前同样要经过一定的衍生化处理，然后在分光光度 计中于560nm检测波长下进行测定。
【附图说明】
[0016] 图1.重组大肠杆菌发酵生产，C3HP的代谢途径。
[0017] 图2.重组质粒PES-Ptrp2-P3H图谱
[0018] 图 3.重组质粒 pET21a-ptrp2-P3H 图谱
[0019] 图4.高效液相色谱结果图，空白对照
[0020] 图5.高效液相色谱结果图，P3H液相色谱图
[0021] 图6.高效液相色谱结果图，L-脯氨酸液相色谱图
【具体实施方式】
[0022] 一般性说明：实施例所涉及的酶均购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒与琼脂糖凝 胶回收试剂盒购自上海生物工程有限公司，操作完全按照相应说明进行。全基因合成由上 海旭冠公司完成。
[0023] LB培养基（％) :1 %胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，I % NaCl，ρΗ7·0。
[0024] Amp抗性平板：1%胰蛋白胨，0.5 %酵母提取物，1 % NaCl，氨苄青霉素 50 μ g/ml， I. 5%琼脂粉。
[0025] 5XKCM(大肠杆菌转化缓冲液）：0· 5M KC1，0. 15M CaCl2,0. 25M MgCL2。
[0026] 实施例1 :脯氨酸-3-羟化酶基因序列的设计
[0027] 对编码脯氨酸-3-羟化酶的基因 P3H进行全基因合成。该合成的DNA序列来自链 霉菌THl (Str印tomyces sp. TH1)，但在该碱基序列中，对P3H基因实施了基因优化处理。具 体优化步骤如下：根据大肠杆菌的密码子使用频率来优化P3H密码子，消除低频密码子，同 时利用同义替换方法消除EcoR I和Xmn I酶切位点，并将终止子改为强终止子TAAT。为便 于将脯氨酸-3-羟化酶基因连接到其他质粒载体上，分别在脯氨酸-3-羟化酶基因的5'端 设计了 EcoR I、Hind III，3'端设计了 BamH I酶切位点。
[0028] 在蛋白的表达过程中，基因序列5'末端的二级结构会对蛋白的翻译产生影响，因 此需对其mRNA的二级结构进行优化，保证起始密码子ATG及其后的数个碱基组成的密码子 呈开环状态，降低核糖体结合到mRNA上的能势，使得核糖体能够顺利地沿着起始密码子向 后翻译。
[0029] 本实施方式中脯氨酸-3-羟化酶基因序列的原始序列，见GenBank:AF003371. 1。 本实施方式中优化的脯氨酸-3-羟化酶基因序列提交给上海旭冠公司进行全基因合成；优 化后的脯氨酸-3-羟化酶结构基因 P3H序列见序列表。
[0030] 实施例2 :脯氨酸-3-羟化酶基因表达载体及重组大肠杆菌的构建
[0031] 合成的P3H用限制性内切酶EcoR I (GAATTC)和Hind III (AAGCTT)处理，使用含 有限制性内切酶 Eco