一种木聚糖酶XynRBM26及其编码基因的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物和基因工程技术领域，尤其涉及的是一种木聚糖酶XynRBM26 及其编码基因。
【背景技术】
[0002] 木聚糖是植物细胞壁中半纤维素的主要组成成分，其完全水解需要木聚糖酶 和木糖苷酶等多种酶的协同作用，木聚糖酶包括内切-I，4_f3-D-木聚糖酶（endo-1， 4_β -D_xylanase，EC 3. 2. 1. 8)和 a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶（a -L-arabinofuranosidase， EC 3· 2.I.55)等（Collins et al. FEMS Microbiol Rev，2005,29:3-23)。内切-1， 4- β -D-木聚糖酶能水解木聚糖主链的β -I，4糖苷键，是木聚糖降解过程中发挥最主要作 用的酶。由于木聚糖酶具有降解植物木聚糖的作用，被广泛应用于食品、饲料、酿酒、造纸、 麻类脱胶和燃料生产等工业领域。
[0003] 植食性动物胃肠道中存在丰富的与木质纤维素降解有关的多种酶类，但不同动 物之间存在差异（Hess et al.Science，2011，331:463-467;Dai et al.PLoS 0ne，2012， 7:e40430)。近年来，研宄者通过微生物分离培养和宏基因组学等方法从天牛胃肠道、奶牛 瘤胃、山羊瘤胃等动物中获取了多种木聚糖酶（Zhou et al. J Ind Microbiol Biotechnol， 2011,38:523-530 ；Cheng et al. J Agric Food Chem,2012,60:12516-12524 ；ffang et al. Bioresour Technol，2011，102:3330-3336)。漬金丝猴（Rhinopithecus bieti)是典型 的植食性灵长类动物，由于摄食种类和物种的差异，其胃肠道中可能蕴含有不同于其它动 物的新的微生物木聚糖酶基因资源，但到目前为止，还未见滇金丝猴胃肠道微生物来源相 关酶基因的报道。
[0004] 木聚糖酶来源比较广泛，在细菌、真菌、陆地植物组织中都存在（Collins et al. FEMS Microbiol Rev，2005, 29:3-23)，其中微生物主要来源于芽孢杆菌属（Bacillus)、 曲霉属（Aspergillus)、里氏木霉属（Trichoderma)等，然而来自Massilia的木聚糖 酶尚未见报道。不同菌属来源的木聚糖酶酶学性质差异较大（Kimura et al.Biosci Biotechnol Biochem，2000,64:1230-1237 ;Gessesse et al. Appl Environ Microbiol， 1998,64:3533-3535)，因此研宄鉴定不同来源的木聚糖酶对其在不同领域的应用具有重要 意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种木聚糖酶。
[0006] 本发明的再一目的是提供编码上述木聚糖酶的基因。
[0007] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组表达载体。
[0008] 本发明的另一目的是提供用所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的重组菌株。
[0009] 本发明从滇金丝猴粪便中分离到Massilia sp. RBM26,通过基因组测序，获得第10 家族的木聚糖酶编码基因，并将其转入大肠杆菌进行异源表达和重组酶的酶学特性分析， 发现获得的木聚糖酶XynRBM26在高浓度NaCl下仍然具有催化活性，可应用于高盐食品和 海产品加工及其它高盐环境生物技术领域，且本发明中的木聚糖酶来源于动物胃肠道，因 此其性质具有进一步应用于饲料等领域的潜力。
[0010] 本发明所述木聚糖酶XynRBM26可得自Massilia sp. RBM26,其编码基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 本发明所述木聚糖酶XynRBM26的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，共383个氨基 酸，其理论分子量为43. 17kDa。
[0012] 本发明的木聚糖酶XynRBM26的最适pH值为5. 5，在ρΗ5· 0-7. 0之间可以保持90 % 以上的酶活性；在pH5. 0-10. 0的缓冲液处理lh，酶活力剩余82%以上；最适反应温度为 45°C，在37°C、45°C和50°C下处理lh，剩余酶活分别为95. 6%、81. 2%和59. 7% ;反应体系 中0. 5-1. 5M的NaCl对酶活影响较小，在5M时仍可以保持86%的活性；经0. 5-5M的NaCl 在37°C下处理lh，发现0.5-3. 5M的NaCl可提高酶活；在反应体系中加入10% (v/v)的乙 醇进行酶促反应，可保持50 %的酶活性，酶经3. 0-15. 0% (v/v)的乙醇在37°C下处理lh， 该酶仍能保持80%左右的酶活性；在pH5. 5及45°C下该酶对0. 5% (w/v)的燕麦木聚糖、 山毛榉木聚糖能有效地水解，而不能水解羧甲基纤维素钠、昆布多糖和β -葡聚糖、微晶纤 维素、p-nitrophenyl- β -D_xylopyranoside〇
[0013] 本发明通过基因组测序的方法克隆了木聚糖酶的编码基因 XynRBM26,其全长为 1152bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA。
[0014] 本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因 XynRBM26的重组载体，优选为 pEasy-E2-XynRBM26。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达 调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明木聚糖酶基因和表达载 体pEasy-E2通过T-A方式相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEasy-E2_XynRBM26。
[0015] 本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因 XynRBM26的重组菌株，优选所述菌株为 大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21 (DE3)/XynRBM26。
[0016] 本发明制备木聚糖酶XynRBM26的方法按以下步骤进行：
[0017] 1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0018] 2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶基因 XynRBM26表达；
[0019] 3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XynRBM26。
[0020] 其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大 肠杆菌细胞BL21 (DE3)，得到重组菌株BL21 (DE3) /XynRBM26。
[0021] 本发明提供了一个新的木聚糖酶基因，其编码的木聚糖酶最适pH为5. 5,最适温 度为45°C，在反应体系中加入5M的NaCl仍然具有86%的酶活，酶经2M NaCl在37°C下处 理lh，活性高达120%;该酶能有效地水解燕麦木聚糖、山毛榉木聚糖，而不能水解羧甲基纤 维素钠、昆布多糖和β _葡聚糖、微晶纤维素、P_nitrophenyl- β -D-xylopyranoside。以上 性质表明本发明的木聚糖酶作为一种新型的酶制剂，可广泛应用于饲料、食品和生物燃料 等行业。
【附图说明】
[0022] 图1 :在大肠杆菌中表达的重组木聚糖酶XynRBM26的SDS-PAGE分析，其中，1 : 500mM咪挫洗脱亲和于Nickel-NTA Agarose中的重组XynRBM26 ;M :蛋白质Marker。
[0023] 图2 :纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的pH活性。
[0024] 图3 :纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的pH稳定性。
[0025] 图4 :纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的热活性。
[0026] 图5 :纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的热稳定性。
[0027] 图6 :纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的NaCl抗性。
[0028] 图7 :纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的NaCl稳定性。
[0029] 图8 :纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的乙醇抗性。
[0030] 图9 :纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的乙醇稳定性。
【具体实施方式】
[0031] 以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0032] 试验材料和试剂
[0033] 1、菌株及载体：Massilia sp. RBM26是本研宄室2013年从我国云南省维西县白马 雪山国家级自然保护区的滇金丝猴粪便微生物中分离得到，其16s rRNA基因序列比对结 果与 Massilia aurea shain AP13(NR_042502)的相似性为 99%。大肠杆菌 Escherichia coli BL21 (DE3)和表达载体pEasy-E2购于北京全式金生物技术有限公司。
[0034] 2、酶类及其他生化试剂：DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司；山毛榉木聚糖 (Beechwood xylan)、p-nitrophenyl-β -D-xylopyranoside 购自 Sigma 公司；燕麦木聚糖 (Xylan from oat spelts)购自 SERVA 公司；Genomic DNA Clean&Concentration 试剂盒购 自 Zymo Research 公司，TureseqTM DNA Sample Preparation Kit 购自 Illumima 公司，其 它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。
[0035] 3、培养基：
[0036] LB 培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馈水至 1000ml，pH 自 然（约为7)。固体培养基在此基础上加2. 0% (w/v)琼脂。
[0037] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0038] 实施例1 :木聚糖酶基因 XynRBM26的克隆
[0039] 提取Massilia sp. RBM26基因组DNA:将