一种重组蚓激酶的制备方法及重组蚓激酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组蚓激酶的制备方法及重组蚓激酶。
【背景技术】
[0002] 在我国传统医药学中，蚯蚓作为中药具有解热、定惊、利尿、降压等功效，蚯蚓提 取物中含有纤溶成分在我国古代医药文献中早已有记载。1982年Mihara自Lumbricus rubellus中提取出一组具有纤溶活性的酶，命名为蝴激酶（lumbrokinase，简写为LK)。虫引 激酶即蚯蚓纤溶酶，是一组从蚯蚓体内分离出的具有抗凝血作用的蛋白酶。自80年代初 日本Mihara等首次发现粉正蚓水提物中有直接溶解纤维蛋白以及激活纤溶酶原的活性物 质以来，至今已经从不同种类蚯蚓体内提纯出多种具有抗凝活性的蛋白组分。研究发现蚓 激酶是一类复杂的蛋白酶，其复杂性表现在组分多样性、结构多样性、酶学特性多样性几方 面。同一种蚯蚓体内能分离出至少两种以上具有抗凝活性但是分子量和生化特征不相同的 蛋白酶。例如在粉正蚓、赤子胜爱蚓体内均分离出多种纤溶酶组分。
[0003] 尽管如此，复杂的蚓激酶仍然具有一些可寻的共性，这些共性表现在以下三个方 面：1、对凝血过程的影响上，所有的蚓激酶都表现为仅对血液凝固后期阶段起作用，而对凝 血因子V、训、爾、仅、\11无显著的影响 ：2、分子结构上，蚓激酶在分子量、氨基酸组成上有 很大的差别，但是它们的N-末端氨基酸序列显示出蚓激酶与胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶具 有一定的相似性，加之其水解底物方式也与这两种酶相似，提示蚓激酶可能属于丝氨酸蛋 白酶类.3稳定性，蚓激酶在pH4~10的范围内都很稳定，同时也是一类热稳定性非常好的 蛋白水解酶，50°C以下可以长久保持活性.通过对蚓激酶药理学研究证实蚓激酶是一类具 有强烈溶栓、抑制血栓形成的蛋白酶，其毒副作用很小，是一种极具开发价值的溶栓药物。
[0004] 目前蚓激酶生产中所遇到的问题： 目前蚓激酶主要的生产方式是从大量蚯蚓中，使用磷酸盐缓冲液分级提取，但是生产 过程中，蚯蚓生长周期长，提取过程繁杂，提取出来的非单一成分等各种因素制约着蚓激酶 大量生产，也影响着蚓激酶制剂的广泛使用。2001年，首次用巴斯德毕赤酵母成功表达了 自粉正蚓中提取的两种纤溶活性成分：F-m-i、F-m-2。并且表达产生的F-m-2的纤溶活 性与天然形式的酶并无差异。但酵母表达系统生产，生产条件要求苛刻，容易污染杂菌，发 酵等需要的设备和配套的设备成本相对很高，进而增加了蚓激酶药品的成本等。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种重组蚓激酶的制备方法。
[0006] 本发明的重组蚓激酶的制备方法，包括如下步骤： 1) 将蚓激酶基因与载体连接，构成重组表达载体； 2) 将步骤1)得到的重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组杆状病毒质粒； 3) 将重组杆状病毒质粒转染家蚕细胞，获得含有蚓激酶基因的重组病毒； 4) 将所述重组病毒接种家蚕，匀浆后纯化获得重组蚓激酶。
[0007] 优选地，步骤1)蚓激酶基因的制备方法为：以赤子爱胜蚓为材料，提取 总RNA，逆转录获得cDNA，并进行RT-PCR扩增蚓激酶基因，引物如下：上游引物： 5 ' -CGCGGATCCATGGAACTTCCTCCCGG，下游引物：5' -GGCCTCGAGTTAGTTGTTGGTGAT。
[0008] 优选地，步骤1)所述载体为pFastBac，步骤2)所述大肠杆菌感受态细胞为DH IOBac大肠杆菌感受态细胞。
[0009] 优选地，步骤1)所述载体为pFastBac ΗΤΑ。
[0010] 作为优选技术方案，步骤3)将重组杆状病毒质粒以脂质体介导法转染家蚕细胞， 得到重组杆状病毒质粒。
[0011] 优选地，步骤3)所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。
[0012] 步骤4)所述家蚕为家蚕成虫、家蚕幼虫或家蚕蛹。
[0013] 作为优选技术方案，步骤4)将所述重组病毒针刺接种家蚕蛹，反应5-7天后，获得 表达蚓激酶的工程蚕蛹，工程蚕蛹匀浆、离心和纯化后获得重组蚓激酶。
[0014] 本发明提供上述方法制备的重组蚓激酶，其序列为SEQ ID NO. 2所示。
[0015] 本发明的有益效果：一是绕开的单纯生物提取技术的问题，包括蚯蚓生长周期长， 提取过程繁杂，提取出来的非单一成分等问题；二是绕开了原核表达产物活性低问题，酵母 表达系统生产的工程成本问题以及植物表达系统生产药物的长周期、低转染效率等问题。 其操作流程相对简单，充分利用低廉的蚕蛹生产蚓激酶，符合低碳经济理念，能结合产业化 生产以满足市场的需要，有较为广阔的市场前景。
【附图说明】
[0016] 图1是本发明的RT-PCR获得蚓激酶基因的PCR产物电泳图；其中，M:核酸分子量 标准；1 :目的基因 PCR产物； 图2是本发明的重组蛋白表达图；M :蛋白分子量标准；1:正常家蚕细胞蛋白样品；2: 发病家蚕细胞样品，其中箭头所指示位置为目的蛋白； 图3是本发明的重组蛋白镍柱纯化后浓缩图；M:蛋白分子量标准；1、2:均为纯化后的 蛋白样品； 图4是本发明的superdex200分子筛实时峰图；其中，2号峰是目的蛋白蚓激酶的峰； 图5是本发明的分子筛后的蛋白电泳图；其中，M:蛋白分子量标准；1、2:均为分子筛 纯化后的蛋白样品。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以 更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0018] 本发明所述的利用昆虫系统表达的蚓激酶的方法是通过RT-PCR的方法获得蚓激 酶基因，并在其5'和3'端分别引入feoT? I、沿W I酶切位点，与转移质粒pFastBac HTA 相连接，获得重组质粒pFast Bac HTA- ZJ，并转化感受态细胞DHlOBac，在DHlOBac细胞内 转移载体PFastBac HTA- ZJ与Bacmid发生转座，将外源基因 ZJ插入到Bacmid上，提取含 有外源基因的重组Bacmid，将其转染入家蚕BmN细胞即可获得含有外源基因 Zf的重组杆状 病毒，人工接种家蚕蛹，经5-7天后收集蛹体，匀浆，进行离心，分离纯化获得重组蚓激酶。
[0019] 下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容： 实验例1 :蚓激酶基因的获得。
[0020] 以赤子爱胜蚓（太平二号）为材料，用Trizol法提取总RNA，已Oligo (dT18)为引物 逆转录获得cDNA，并进行RT-PCR扩增蚓激酶基因，引物如下： 上游引物：5 ' -CGCGGATCCATGGAACTTCCTCCCGG 下游引物：5 ' -GGCCTCGAGTTAGTTGTTGGTGAT PCR反应体系为：
【主权项】
1. 一种重组蚓激酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 将蚓激酶基因与载体连接，构成重组表达载体； 2) 将步骤1)得到的重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组杆状病毒质粒； 3) 将重组杆状病毒质粒转染家蚕细胞，获得含有蚓激酶基因的重组病毒； 4) 将所述重组病毒接种家蚕，匀浆后纯化获得重组蚓激酶。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)蚓激酶基因的制备 方法为：以赤子爱胜蚓为材料，提取总RNA，逆转录获得cDNA，并进行RT-PCR扩增 蚓激酶基因，引物如下：上游引物：5 ' -CGCGGATCCATGGAACTTCCTCCCGG，下游引物： 5'-GGCCTCGAGTTAGTTGTTGGTGAT〇
3. 根据权利要1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述载体为pFastBac，步骤2) 所述大肠杆菌感受态细胞为DHIOBac大肠杆菌感受态细胞。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述载体为pFastBacHTA。
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)将重组杆状病毒质粒以脂质 体介导法转染家蚕细胞，得到重组杆状病毒质粒。
6. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述家蚕细胞为家蚕BmN细 胞。
7. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述家蚕为家蚕成虫、家蚕幼 虫或家蚕蛹。
8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤4)将所述重组病毒针刺接种家 蚕蛹，反应5-7天后，获得表达蚓激酶的工程蚕蛹，工程蚕蛹匀浆、离心和纯化后获得重组 蚓激酶。
9. 权利要求广8任一项制备的重组蚓激酶，其序列为SEQIDNO. 2所示。
【专利摘要】本发明公开了一种重组蚓激酶的制备方法，包括如下步骤：1）将蚓激酶基因与载体连接，构成重组表达载体；2）将步骤1）得到的重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组杆状病毒质粒；3）将重组杆状病毒质粒转染家蚕细胞，获得含有蚓激酶基因的重组病毒；4）将所述重组病毒接种家蚕，匀浆后纯化获得重组蚓激酶。本发明的方法，流程相对简单，充分利用低廉的蚕蛹生产蚓激酶，符合低碳经济理念，能结合产业化生产以满足市场的需要，有较为广阔的市场前景。
【IPC分类】C12N9-68
【公开号】CN104726437
【申请号】CN201310696443
【发明人】张耀洲, 杨晓丽, 毕臻乐, 王小飞, 舒特俊, 陈剑清
【申请人】天津耀宇生物技术有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2013年12月18日