一种用于肺癌组织分型的miRNA标志物及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种用于肺癌组织分型的miRNA标志物及应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因 的第1位。非小细胞型肺癌包括鳞状细胞癌（鳞癌）、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌 细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚，非小细胞肺癌约占所有肺癌的80 %，约75%的患 者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。其中，肺腺癌和肺鳞癌又是非小细胞肺癌中的两 种最常见的肿瘤。各病理类型的肺癌在肿瘤的生物学行为、对放疗、化疗及分子靶向药物的 敏感性等方面存在差异，各型预后也不相同。因此，在临床上对肺癌作出诊断时，明确其病 理分型对制订治疗方案、分析预后非常重要。
[0003] 目前医学界对肺癌的病理分型主要依靠微观形态学及免疫组织化学方法。传统的 病理组织学方法是将获取的病变组织通过固定、脱蜡、染色等步骤，制作成切片在在显微镜 下分辨其微观结构。该方法步骤繁多，需要白白等待一二天的时间，在病理学专业人员对切 片进行判读时也难免主观性。因此，临床上迫切的需要一种快捷、有限、准确的肺癌的病理 分型方法。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是：一种用于肺癌组织分型的miRNA标志物。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种用于肺癌组织分型的 miRNA 标志物，所述标记物包括 miRNA-205、miRNA-21 和 miRNA-26b。
[0006] 在本发明的第二方面，提供了上述miRNA标志物在制备肺癌组织分型试剂盒中的 应用。
[0007] 在本发明的第三方面，提供了一种肺癌组织分型试剂盒，其能够测定组织中的 miRNA-205、miRNA-21 和 miRNA-26b 的含量。
[0008] 在本发明的一个优选例中，上述试剂盒含有miRNA-205、miRNA-21和miRNA-26b的 引物探针。
[0009] 在本发明的一个优选例中，上述引物探针的序列如SEQ ID NO. 1、SEQ IDNO. 2和 SEQ ID NO. 3 所示。
[0010] 在本发明的第四方面，提供了核苷序列如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2或SEQ IDNO. 3中的一种或多种组合物在制备肺癌组织分型试剂盒中的应用。
[0011] 在本发明的一个优选例中，提供了序列如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2和SEQ IDNO. 3所示引物探针的用途，其用于制备肺癌组织分型试剂盒。
[0012] 所述诊断试剂盒还可以包括PCR反应常用试剂，如Taq酶，逆转录酶，缓冲液， dNTPs，MgCljP DEPC水等；还可以含有标准品和/或对照品。
[0013] 本发明的有益效果在于：首次发现了对肺癌组织分型具有极高诊断价值（AUCS 1.000，敏感度和特异度分别为100%和100%)的生物标记物组合11^1?^-205、1^1?^-21和 miRNA-26b ;通过血衆miRNA标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可以使得肺癌组织分型更 加方便易彳T，为临床医生快速准确掌握患者病情，为提尚临床治疗效果奠定基础，并为发现 具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
【附图说明】
[0014] 图1为肺腺癌与肺鳞癌肿瘤组织miRNA表达水平比较。
[0015] 图2为肺腺癌与肺鳞癌肿瘤组织miRNA表达水平ROC曲线。
【具体实施方式】
[0016] -、研宄对象
[0017] 病例组为2012年11月至2014年3月在常州市第二人民医院收集的42例病例， 均经病理组织学确诊，采血前未经过手术和放化疗。其中肺腺癌27例，肺鳞癌15例；按性 别和年龄（±5岁）与病例进行频数匹配。用于研宄的样本为同期收取，采样、分装、保存条 件均一，通过对样品资料的整理。
[0018] 二、研宄方法
[0019] (1)肿瘤组织石蜡包埋，切片。
[0020] (2)按照石蜡组织总RNA提取试剂盒（miRNeasy FFPE Kit，货号NO. 217504,德国 Qiagen公司）说明书从石蜡组织中提取总RNA。
[0021] (3)按照miRNA逆转录试剂盒（TaqManmicroRNA反转录试剂盒，货号 NO. 1302146R，美国ABI公司）说明书进行逆转录反应。反应总体积为15ul (总RNA5ul， TaqManMicroRNAAssay 3ul,核酸酶自由水 4. 16ul，RNase 抑制剂 0. 19ul，缓冲液 I. 5ul， Multiscribe 逆转录酶 LOOul 和 dNTPO. 15ul)，在不同温度下（16°C，42°C，85°C，4°C )进 行不同时长（30mins，30mins，5mins，IOmins)反应。使用RNU44为内参，进行数据归一化校 正。
[0022] (4)实时荧光定量PCR按照TaqMan试剂盒（TaqMan通用混合试剂盒II，货号 NO. 121207,美国ABI公司）说明书进行。PCR扩增体系总体积为10ul，反应共40个循环。 PCR反应Ct值通过7900实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）测定，每个反应重复三次。
[0023] 三、研宄结果
[0024] 肺腺癌和肺鳞癌两组病例的肿瘤组织中miRNA-205, miRNA-21，miRNA-26b表达水 平有显著差异，其中，miRNA-205在肺鳞癌中比在肺腺癌中显著上调；miRNA-21，miRNA-26b 在肺鳞癌中比在肺腺癌中显著下调。具体数据如图1和表1所示：
[0025] 表1 :肺腺癌与肺鳞癌肿瘤组织miRNA表达水平比较（Λ CT) (X土 S)
[0026]
【主权项】
1. 一种用于肺癌组织分型miRNA标志物，所述标记物包括miRNA-205、miRNA-21和 miRNA-26b。
2. -种如权利要求1所述的用于肺癌组织分型的miRNA标志物在制备肺癌组织分型试 剂盒中的应用。
3. -种肺癌组织分型试剂盒，其能够测定组织中的miRNA-205、miRNA-21和miRNA-26b 的含量。
4. 如权利要求3所述的肺癌组织分型试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有miRNA-205、 miRNA-21和miRNA-26b的引物探针。
5. -种如权利要求4所述的肺癌组织分型试剂盒，其特征在于引物探针的序列如SEQ IDNO. 1、SEQIDNO. 2 和SEQIDNO. 3 所示。
6. 核苷序列如SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2或SEQIDNO. 3中的一种或多种组合物在 制备肺癌组织分型试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及一种用于肺癌组织分型的miRNA标志物及应用。本发明提供了用于肺癌组织分型的miRNA标志物，包括miRNA-205、miRNA-21和miRNA-26b；本发明还提供了序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、和SEQ ID NO.3所示的引物探针及其在制备肺癌组织分型试剂盒中的应用。本发明的有益效果在于首次发现了对肺癌组织分型具有极高诊断价值(AUC为1.000，敏感度和特异度分别为100％和100％)的生物标记物，并提供了能检测这些生物标记物在组织中含量的试剂盒。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104726448
【申请号】CN201410848918
【发明人】卢正斌
【申请人】常州杰傲病理诊断技术有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2014年12月29日