一种用于预防和/或治疗HIV的CRISPR-Cas9系统及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因治疗药物领域，特别涉及HIV的基因治疗领域，尤其涉及一种用 于预防和/或治疗HIV的CRISPR-Cas9系统及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus或HIV)属逆转录病毒，是一 种感染人类免疫系统细胞的慢病毒，能造成人类免疫系统缺陷，使人体失去抵抗力，易产生 各种疾病甚至癌症。其导致的疾病一一艾滋病至今无有效疗法，具有致命性。
[0003] 预防传染病的常规手段是人为干预和疫苗，人为干预（如避孕套等）无法真正意 义上消除HIV，仅作为限制HIV的一种物理性强制手段；而相关疫苗虽然经历了三十多年的 探索和开发，至今尚未有成熟的产品问世。因此，现行的HIV主要疗法为高效联合抗逆转录 病毒法，但其同样只能延缓HIV的发展。与以上疗法不同的是，基因治疗一直被视为HIV治 疗的最理想模式；因其理论上可以达到预防和消除HIV的效果。
[0004] 近年来，CRISPR-Cas9技术因其高效性和简便性被迅速推广和应用。它是细菌和 古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可用来对抗入侵的病毒及外源 DNA。CRISPR-Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR，并利用相应的 CRISPR RNAs(SgRNAs)来指导同源序列的降解。该系统的主要组成部分为：（I)SgRNA序列， 负责革G向特异性基因位点；（2) Cas9酶，负责对祀向位点的DNA进行修饰切割。目前，这一 技术主要应用于基因修饰动物模型的构建，而将其开发为HIV预防性或治疗性的药物则很 少被涉及。在公开发表的论文"RNA-directed Gene Editing Specifically Eradicates Latent and Prevents New HIV-lInfection"中，刘文辉等根据HIV基因的两个片段序列构 建了一个长度为20bp的SgRNA，其能靶向位于HIV序列5' LTR的HIV-1U3位点；由于位点 单一等原因，该系统仅能说明其对于HIV的抑制具有关联性，但抑制的效果十分有限。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种用于预防和/或治疗HIV的CRISPR_Cas9系统及其制 备方法和用途。
[0006] 为达到以上目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 第一方面，本发明提供一种用于预防和/或治疗HIV的CRISPR_Cas9系统，其包括 特异性靶向HIV基因组上的特定基因位点的SgRNA，所述HIV基因组上的特定基因位点选自 Gag、Env、Pol、Tat、Nef、Vif、Vpr、Vpu、5' LTR、3' LTR 和 Rev。
[0008] 优选地，所述HI V基因组上的特定基因位点包括Gag、Env、Po I、Tat、Nef、Vi f、Vpr、 Vpu、5' LTR、3' LTR 和 Rev。
[0009] 优选地，特异性靶向每个基因位点的sgRNA为1条以上，例如可以是1条、2条、3 条、4条、5条、6条、7条、8条、9条、10条或11条，进一步优选为4条。
[0010] 进一步优选地，每条sgRNA的长度为16_22bp，例如可以是16bp、17bp、18bp、19bp、 20bp、21bp 或 22bp。
[0011] 优选地，所述CRISPR-Cas9系统还包括Cas9。
[0012] 优选地，所述Cas9和所述特异性靶向HIV基因组上的特定基因位点的sgRNA分别 存在于质粒中。
[0013] 第二方面，本发明提供第一方面所述药物的制备方法，PCR扩增所用引物选 自 Cas9-5' LTR-I 引物对、Cas9-5' LTR-2 引物对、Cas9-5' LTR-3 引物对、Cas9-5' LTR-4 引物对、Cas9-Pol-l 引物对、Cas9-Pol-2 引物对、Cas9-Pol-3 引物对、Cas9-Pol-4 引 物对、Cas9-vif-l 引物对、Cas9-vif-2 引物对、Cas9-vif-3 引物对、Cas9-vif-4 引物 对、Cas9_vpr_l 引物对、Cas9_vpr_2 引物对、Cas9_vpr_3 引物对、Cas9_tat_l 引物 对、Cas9-tat_2 引物对、Cas9-tat_3 引物对、Cas9-tat_4 引物对、Cas9-rev2_l 引物 对、Cas9-rev2_2 引物对、Cas9-rev2_3 引物对、Cas9-vpu_l 引物对、Cas9-vpu_2 引物 对、Cas9_env_l 引物对、Cas9_env_2 引物对、Cas9_env_3 引物对、Cas9_env_4 引物 对、Cas9-nef_l 引物对、Cas9-nef_2 引物对、Cas9-nef_3 引物对、Cas9-nef_4 引物对、 Cas9-3' LTR-I 引物对、Cas9-3' LTR-2 引物对、Cas9-3' LTR-3 引物对、Cas9-Gag-1 引物对、 Cas9-Gag_2 引物对、Cas9-Gag_3 引物对和 Cas9-Gag_4 引物对；
[0014] 所述引物对的序列按5'-3'方向如下：
[0015] Cas9_5, LTR-I 引物对：
[0016] gacaagatatccttggtttt，和 CAAGGATATCTTGTCcggtg ;
[0017] Cas9_5' LTR-2 引物对：
[0018] cctatgagcctgcagtttt，和 TGCAGGCTCATAGGcggtg ;
[0019] Cas9_5' LTR-3 引物对：
[0020] gctttttgcctgtagtttt，和 TACAGGCAAAAAGCcggtg ;
[0021] Cas9_5' LTR-4 引物对：
[0022] gacccttttagtcagtggtttt，和 CACTGACTAAAAGGGTCcggtg ;
[0023] Cas9-Pol_l 引物对：
[0024] aataccacatcccgcagtttt，和 TGCGGGATGTGGTATTCcggtg ;
[0025] Cas9-Pol_2 引物对：
[0026] ccacagggatggaagtttt，和 TTCCATCCCTGTGGcggtg ;
[0027] Cas9-Pol_3 引物对：
[0028] gtcagatttatgcgtttt，和 GCATAAATCTGACcggtg ;
[0029] Cas9-Pol_4 引物对：
[0030] cctggattcctgaatgtttt，和 ATTCAGGAATCCAGGcggtg ;
[0031] Cas9-vif_l 引物对：
[0032] tcagaagtacacatcccag，和 GATGTGTACTTCTGAcggtg ;
[0033] Cas9-vif_2 引物对：
[0034] acatattggggtctgcatacgtttt，和 CAGACCCCAATATGTcggtg ;
[0035] Cas9-vif_3 引物对：
[0036] gccagggagtctccatagaagtttt，和 TTCTATGGAGACTCCcggtg ;
[0037] Cas9-vif_4 引物对：
[0038] gatctctacaatactgtttt，和 AGTATTGTAGAGATCcggtg ;
[0039] Cas9-vpr_l 引物对：
[0040] atggctccatagcttgtttt，和 AAGCTATGGAGCCATcggtg ;
[0041] Cas9-vpr_2 引物对：
[0042] ggagatacttggacgtttt，和 GTCCAAGTATCTCCcggtg ;
[0043] Cas9-vpr_3 引物对：
[0044] tgccaacatagcagaatgtttt，和 ATTCTGCTATGTTGGCAcggtg ;
[0045] Cas9-tat_l 引物对：
[0046] agccctggaagcatccgtttt，和 GGATGCTTCCAGGGCTcggtg ;
[0047] Cas9-tat_2 引物对：
[0048] ccaggaagtcagcctgtttt，和 AGGCTGACTTCCTGGcggtg ;
[0049] Cas9-tat_3 引物对：
[0050] atggcaggaagaaggtttt，和 CTTCTTCCTGCCATAcggtg ;
[0051] Cas9_tat_4 引物对：
[0052] cgaaggaatcgaagagtttt，和 TCTTCGATTCCTTCGcggtg ;
[0053] Cas9_rev2_l 引物对：
[0054] tcttagcactgttctgtttt，和 AGAACAGTGCTAAGAcggtg ;
[0055] Cas9_rev2_2 引物对：
[0056] acttactcttgattgtagcggtttt，和 ACAATCAAGAGTAAGTcggtg ;
[0057] Cas9_rev2_3 引物对：
[0058] ggtgggaagtcctcatgtttt，和 ATATTTGAGGACTTCCCACCcggtg ;
[0059] Cas9_vpu_l 引物对：
[0060] caataatagcaatagttatagtttt，和 TATAACTATTGCTATTATTGcggtg ;
[0061] Cas9_vpu_2 引物对：
[0062] ccatagtattaataaaatatgtttt，和 ATATTTTATTAATACTATGGcggtg ;
[0063] Cas9_env_l 引物对：
[0064] catggtagaccagatgcatggtttt，和 CATGCATCTGGTCTACCATGcggtg ;
[0065] Cas9_env_2 引物对：
[0066] tgctctttcaatatcaccacgtttt，和 GTGGTGATATTGAAAGAGCAcggtg ;
[0067] Cas9_env_3 引物对：
[0068] gtctagcagaagaaggtttt，和 CTTCTTCTGCTAGACcggtg ;
[0069] Cas9_env_4 引物对：
[0070] ctgctattaacaagagagtttt，和 TCTCTTGTTAATAGCAGcggtg ;
[0071] Cas9-nef_l 引物对：
[0072] aatgggatggcctgctgtaagtttt，和 TTACAGCAGGCCATCCCATTcggtg ;
[0073] Cas9-nef_2 引物对：
[0074] gagctgagccagcagcagatgtttt，和 ATCTGCTGCTGGCTCAGCTCcggtg ;
[0075] Cas9-nef_3 引物对：
[0076] gggagcagcatctagagaccgtttt，和 GGTCTCTAGATGCTGCTCCCcggtg ;
[0077] Cas9-nef_4 引物对：
[0078] tgcctggctagaagcacaaggtttt，和 CTTGTGCTTCTAGCCAGGCAcggtg ;
[0079] Cas9_3, LTR-I 引物对：
[0080] gatttccactgacctttggagtttt，和 TCCAAAGGTCAGTGGAAATCcggtg ;
[0081] Cas9_3, LTR-2 引物对：
[0082] cggagaaagaagtgttagtggtttt，和 CACTAACACTTCTTTCTCCGcggtg ;
[0083] Cas9_3, LTR-3 引物对：
[0084] ctttccgctggggactttccgtttt，和 GGAAAGTCCCCAGCGGAAAGcggtg ;
[0085] Cas9-Gag_l 引物对：
[0086] gtcagtattaagtgcgtttt，和 GCACTTAATACTGACcggtg ;
[0087] Cas9-Gag_2 引物对：
[0088] cacaggaaaaggcagccgtttt，和 GGCTGCCTTTTCCTGTGcggtg ;
[0089] Cas9-Gag_3 引物对：
[0090] gaacgatttgcagtcaagtttt，和 TTGACTGCAAATCGTTCcggtg ;
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