hsa-miR-1280在非小细胞肺癌中的作用及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及miRNA在癌症诊断中的应用，以及其用作非小细胞肺癌的诊断用途。
【背景技术】
[0002] 肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均位于恶性肿瘤之首。非 小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)约占其80%，近些年疗效虽有提高， 但长期生存率仍较偏低，绝大多数患者确诊时已是癌症晚期，只能采取姑息性治疗，预后较 差。
[0003] 侵袭和转移是癌细胞从原发性部位转移到远端部位形成肿瘤的过程，它是一个多 步骤、多因素参与的复杂生物学过程，是导致NSCLC复发和影响预后的重要因素，也是导致 患者死亡的主要原因，目前对NSCLC的侵袭和转移机制尚不清楚。一直以为肿瘤的发生是 由一系列致癌基因和抑癌基因突变逐步形成的，但随着非编码RNA的发现，此传统观念被 改变。最近的研宄表明，非编码RNA中的成员microRNA分子广泛参与了肿瘤侵袭和转移过 程中的基因表达调控，这一发现为肿瘤转移的诊断和治疗提供了新的思路。
[0004] microRNA是由内源基因编码，长约19-24nt的非编码小RNA，可通过形成RNA 诱导沉默复合体（RNA induced silencing complex, RISC)与革El基因3'端非翻译区 (untranslated region, UTR)互补结合，诱导mRNA的切割降解，翻译抑制或其他形式的 调节机制抑制靶基因的表达。目前已发现的人类microRNA已达1000多种，超过50%的 microRNA基因定位于肿瘤相关的染色体座位或其易感位点，并证实部分microRNA异常表 达与特定的肿瘤有着密切的关系，并参与了恶性肿瘤发展的多个过程，包括细胞分化、增 殖、侵袭和转移。
[0005] microRNA在NSCLC的侵袭和转移中起至关重要的作用。Grawford等将miRNA-126 转染入肺鳞癌细胞系，与空白对照组及转染入无序pre-microRNA的细胞相比，前者细胞的 侵袭和转移能力下降。Yu等将高危险性（死亡危险比>1)的microRNA前体和保护性（死亡 危险比〈1)的microRNA前体分别转染入低侵袭性和高侵袭性的肺癌细胞系中，发现转入高 危险性microRNA的肺癌细胞系渗入基质胶膜的侵袭性增强，而转染保护性microRNA的肺 癌细胞系侵袭性降低，表明这些microRNA与肺癌的侵袭转移相关。Zhang等利用莖环状反 转录实时PCR方法（stem-loop qRT-PCR)对20对NSCLC和癌旁组织的miR-21进行了定量， 并利用western blot技术检测了 miR-21的靶基因 PTEN的表达情况，发现miR-21在NSCLC 中有较高的表达，而抑癌基因 PTEN的蛋白表达情况则相反，接着将载有miR-21转录抑制子 的质粒转染NSCLC细胞，结果显著降低了细胞的生长和侵袭作用，表明miR-21的表达降低 了抑癌基因 PTEN的表达，促进了 NSCLC细胞的生长和侵袭。Zhu等的研宄也发现，miR-21 通过靶向多个肿瘤转移抑制基因，调控乳腺癌、肺癌的侵袭和转移。Wang等用microRNA芯 片技术筛选出了在肺癌和癌旁两种细胞中有显著表达差异的miR-183,并发现miR-183与 肺癌细胞的转移潜能负相关，推测其为潜在的转移抑制因子，进一步的研宄发现，miR-183 的过表达抑制了肺癌细胞的转移和侵袭。
[0006] microRNA的研宄不仅为肿瘤发生发展机制的探明提供了新的思路和方法，而且在 临床诊疗和预后评估方面显示了很高的应用价值。microRNA参与了肿瘤发生发展的各个阶 段，每一个阶段都有相应的microRNA发生变化。而且，microRNA具有很好的组织特异性， 经筛查检测48个microRNA确定肿瘤的组织来源准确率达90%。同时，microRNA又具有肿 瘤发生的阶段特异性，同一种肿瘤在发生发展不同分期阶段具有不同的microRNA表达谱。 因此，microRNA可以作为一种有效的肿瘤标志物用于癌症的早期诊断、恶性分级、个性化诊 疗和预后判断等，甚至可以作为肿瘤治疗的靶点，指导临床用药。
[0007] 虽然肿瘤组织microRNA表达谱与肿瘤发病及预后相关，但是检测技术复杂、创伤 大，难以真正用于临床诊断，而外周血血清较易获得和检测，临床应用便捷，利于推广，并且 microRNA在血清中能够长期稳定存在，不易被RNA酶降解，煮沸、反复冻融、酸碱环境、长期 保存等极端条件均不会造成血清microRNA的损失。更重要的是，血清中microRNA表达谱 的变化与肿瘤的组织密切相关，能够提示肿瘤的状态。Chen等的研宄显示，在非小细胞肺癌 血清中，miR-25和miR-223表达显著上调。Ng等以血清miR-92作为分子标志物，可以诊断 I~IV期的结直肠癌，灵敏度可达89%，特异性达到70%。这充分体现了血清microRNA在 肿瘤诊疗中的应用价值。
[0008] 本发明旨在利用hsa-miR-1280在癌组织和远端正常组织敏感性和特异性方面的 比较，评估其作为临床上非小细胞肺癌的早期诊断的可行性。
【发明内容】
[0009] 本发明通过建立NSCLC患者病理和术后随访资料库，建成组织样本库和血清样本 库200余例。其中有30例已经取得术前、术后和复发后血清，每三个月进行回访，并记录 相应随访资料。在已完成10对NSCLC癌及癌旁标本的microRNA芯片分析的基础上，本研 宄将筛选具有差异表达的microRNA，并基于生物信息学分析以及RIP实验技术确定其靶基 因，探明microRNA在NSCLC侵袭和转移中的调控机制，同时，筛查NSCLC患者不同的病理阶 段时，血清中NSCLC转移特异的microRNA标志物，为NSCLC转移提供早期有效的监控手段。
[0010] 本发明的目的在于提供一种miRNA，即hsa-miR-1280,其可用于在非小细胞肺癌 的检测。
[0011] 本发明的技术方案如下：
[0012] (1)筛选NSCLC组织与对应癌旁组织差异表达的microRNA ;
[0013] (2)生物信息学预测并鉴定microRNA的靶基因；
[0014] (3)考察差异microRNA对细胞生长的影响；
[0015] (4)研宄差异microRNA及其对应靶基因在NSCLC肿瘤侵袭和转移中的作用。
[0016] (5)验证NSCLC血清与非癌对照血清差异表达的microRNA，评估其作为血清NSCLC 候选标志物，用于NSCLC早期转移诊断、疗效监控的可能性。
[0017] 更进一步地，本发明的技术方案如下：
[0018] (1)巩固和完善NSCLC数据库
[0019] A建立和整理NSCLC患者病理资料和术后随访资料数据库，收集和整理患者的病 理档案、术后治疗方案及效果、术后生存情况等数据；
[0020] B建立和整理NSCLC组织样本库（已完成200例NSCLC组织样本收集）；
[0021] C建立和整理NSCLC患者及对照人群的血液样标本库。
[0022] (2) NSCLC及癌旁组织差异microRNA的筛选
[0023] A样本收集：选取临床确诊的NSCLC患者10例，取癌及对应的癌旁组织，共20例 标本；
[0024] B样本总RNA提取：采用总RNA提取方法提取20例标本的总RNA ;
[0025] C利用microRNA提取试剂盒分离提取总RNA中的microRNA ;
[0026] D利用哺乳动物microRNA芯片（Affymetrix)，对收集到的20例标本的microRNA 样品进行筛选实验，共做20张芯片；
[0027] E应用芯片统计分析软件，分析癌组织和癌旁组织差异的microRNA。
[0028] (3)扩大样本实验验证和microRNA的进一步筛选
[0029] A利用Real-timePCR技术验证芯片实验中癌与癌旁组织差异显著的microRNA 结果，对这些microRNA进行生物信息学分析，选取8-10个与肿瘤侵袭和转移相关的 microRNA，扩大肺癌组织样本到100对进行验证；
[0030] B根据上述NSCLC病例的病理学资料，对选取的8-10个microRNA进行分析，考察 在不同的病理分期的NSCLC患者中的表达量分布情况。
[0031] (4) RIP技术确定差异microRNA的靶基因，生物信息学查询并参照文献报道，预测 microRNA的功能，选取1-2个与NSCLC侵袭和转移相关的microRNA进行后续研宄。
[0032] (5)microRNA的Ientivirus过