构建lqt疾病模型的方法及其在筛选药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及构建LQT疾病模型的方法及其在筛选药 物中的应用。
【背景技术】
[0002] 先天性长QT综合征（long QT syndrome，LQTS)属于遗传性心律失常，是由于编码 心肌细胞离子通道的基因异常所导致，也被称为"离子通道病"。LQTS患者具有QT间期延 长（大于0. 48秒）和T波形态异常的心电图特征，临床表现为反复发作的晕厥和室性心律 失常，尤其是尖端扭转性室性心动过速（Torsade de pointes, TdP)。据统计，未经治疗的 LQTS患者的10年死亡率高达50%，且约1/2500的患者终身伴随猝死风险。美国近年数据 显示，LQTS在人群中的发病率约1:2000~1:5000,尤其多见于儿童和青少年。据此推算， 我国LQTS患者接近30万。由于LQTS具有发病突然、猝死率高、青少年多发的特点，已成为 遗传性心律失常的研宄前沿和热点。目前认为先天性LQTS是由于调控心室肌细胞膜复极 化离子通道的基因发生突变所致。
[0003] 然而，目前关于LQTS疾病模型的研宄仍有待深入。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的 一个目的在于提出一种具有能够有效构建LQT疾病模型的方法。
[0005] 在本发明的第一方面，本发明提供了一种构建心肌细胞的方法，构建获得的心肌 细胞可以作为LQT疾病模型。根据本发明的实施例，该方法包括：（1)利用附着体载体，将 重编程因子编码基因引入携带LQTS相关突变基因的体细胞中，以便获得诱导多能干细胞； 以及（2)在适于所述诱导多能干细胞分化的条件下，培养所述诱导多能干细胞，以便获得 心肌细胞，所述心肌细胞构成所述LQTS疾病模型。发明人发现，利用本发明的该方法，能够 快速有效地制备获得LQTS疾病模型，且适于构建JLNS型LQT疾病S疾病模型，另外，本发 明的方法利用附着体载体方式进行重编程，避免了逆转录病毒引起的基因组不稳定性及潜 在的致癌性的风险，提高重编程效率。已知附着体质粒在作为载体将外源基因引入细胞中 时，不会整合到供体细胞基因组中，并且附着体质粒可以在后续细胞传代过程中丢失，因此 可以得到无外源基因整合的重组细胞。但之前的很多尝试利用附着体质粒作为载体将重编 程因子引入体细胞中来获得诱导多能干细胞（iPSC)都未能成功，原因在于获得诱导多能 干细胞需要同时转入多个重编程因子，成功效率低。
[0006] 本发明的发明人通过采用经过优化的重编程因子的组合以及附着体质粒的分配， 可以成功地将重编程因子引入到来自LQT疾病患者的体细胞中。在本文中，所使用的术语 "重编程因子"是指一种或多种生物活性因子（例如生物活性因子混合物），其作用在细胞 上以改变转录，从而使细胞重编程为多潜能性（multipotency)或多能性（pluripotency) 细胞。可以向细胞提供重编程因子，所述细胞例如来自具有感兴趣心脏病的家族史或遗传 组成的个体的细胞，例如成纤维细胞、脂肪细胞、尿液细胞等，这些因子能够单独提供或以 重编程因子的单一组合物（即预先混合的组合物）来提供。可以相同的摩尔比或不同的摩 尔比来提供该因子。可以在培养本发明的细胞的过程中一次或多次提供该因子。根据本发 明的实施例，所述重编程因子包括：0CT4、S0X2、KLF4、NANOG、SV40LT、L-MYC和LIN28。由此， 有利于提高重编程效率。根据本发明的实施例，所述附着体载体包括：第一附着体质粒，所 述第一附着体质粒携带编码0CT4的核苷酸序列、编码S0X2的核苷酸序列、编码KLF4的核 苷酸序列、编码NANOG的核苷酸序列；第二附着体质粒，所述第二附着体质粒携带编码0CT4 的核苷酸序列、编码S0X2的核苷酸序列、编码KLF4的核苷酸序列、编码SV40LT的核苷酸序 列；以及第三附着体质粒，所述第三附着体质粒携带编码L-MYC的核苷酸序列、编码LIN28 的核苷酸序列。由此，能够有效提高重编程效率，且第三附着体质粒携带编码L-MYC的核苷 酸序列可以大大降低致癌风险。在本发明的实施例中，发明人还利用常规的逆转录病毒转 染方法来获得诱导多能干细胞，通过比较发现，通过采用上述附着体质粒组合，可以实现下 列优点的至少之一：
[0007] 1)安全，根据本发明的实施例，可以获得无外源基因整合的iPSC，具有很大的细 胞治疗方面的潜力；而逆转录病毒在重编程过程中会整合到细胞基因组中去，会对供体细 胞基因组造成一定的干扰，并有致癌风险。
[0008] 2)与传统质粒相比，附着体质粒的表达时间较长，可以随细胞的复制而复制，丢失 较慢，因此对于2-3周的重编程来讲，可以起到稳定表达外源基因的作用。
[0009] 根据本发明的实施例，所述携带LQT相关突变基因的体细胞为来自LQT患者的尿 液细胞。由此，避免了从皮肤等部位取样而对患者造成的疼痛和伤害。本发明的发明人惊 奇地发现利用本发明经过优化的重编程因子的组合以及附着体质粒的分配，可以成功地将 重编程因子引入到来自LQT疾病患者的尿液细胞中。
[0010] 根据本发明的实施例，所述LQT相关突变基因与SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列 (NCBI索取号：CCDS7736. 1)相比具有c. 605-2A>G/c. 815G>A的突变。换句话说，也就是SEQ ID NO: 1中第605位的A突变为G，第815位的G突变为A。
[0011] 根据本发明的实施例，步骤（1)进一步包括：（1-1)将所述附着体载体转染所述携 带LQT相关突变基因的体细胞中，得到转染后的体细胞；（1-2)于37°C、5% CO2条件下，利 用无滋养层人诱导多能干细胞（hiPSC)重编程培养基培养所述转染后的体细胞；（1-3)在 转染后的第15天将培养基换成mTeSRl继续培养；（1-4)在转染后的第25天，选取具有典 型人诱导多能干细胞形态的克隆进行纯化扩增，以便获得所述诱导多能干细胞。由此，能够 快速有效地制备获得诱导多能干细胞，且重编程效率高、致癌风险低、安全性高。另外，获得 的诱导多能干细胞核型正常，高表达多能性标记物内源0ct4和内源Sox2, Nanog，Rexl，表 达量与人胚胎干细胞株H9相当。
[0012] 根据本发明的实施例，所述编码0CT4的核苷酸序列具有如SEQ ID NO :2所示的 序列；所述编码S0X2的核苷酸序列具有如SEQ ID NO :3所示的序列；所述编码NANOG的核 苷酸序列具有如SEQ ID NO :4所示的序列；所述编码SV40LT的核苷酸序列具有如SEQ ID NO :5所示的序列；所述编码KLF4的核苷酸序列具有如SEQ ID NO :6所示的序列；所述编码 L-MYC的核苷酸序列具有如SEQ ID NO :7所示的序列；以及所述编码LIN28的核苷酸序列 具有如SEQ ID NO :8所不的序列。由此，发明人发现可以进一步提尚重编程的效率。
[0013] 根据本发明的实施例，由诱导多能干细胞分化为心肌细胞的方法并不受特别限 制，发明人经过多次筛选实验，发现，可以所述心肌细胞是通过下列步骤获得的。具体的， 步骤⑵进一步包括：（2-1)利用分散酶对步骤⑴中所得到的所述诱导多能干细胞进行 分散，（2-2)按照2X10 5个细胞/10平方厘米，将所述多能干细胞接种在包被基质胶的含有 mTeSRl培养基的平板上，并培养至融合度为70~90%融合度；（2-3)在超慢贴附六孔板 中，使用ACCUTASE细胞消化液，将步骤（2-2)中所得到的培养物消化为单细胞，并在含有 Matrigel (40mg/mL)、BMP4 (Ing/mL ;Invitrogen)和 Rho 激酶抑制剂（ROCK) (IOmM ;R&D)的 mTeSRl培养基中5%氧气条件下进行培养24小时；（2-4)将步骤（2-3)中所得的培养物 进行清洗，并更换为含有抗坏血酸（AA, 50mg/mL ;Sigma)、2mM Gluta-MAX-I (Invitrogen)、 BMP4(10ng/mL)和人重组激活素-A(10ng/mL ;Invitrogen)的 StemPro34SFM培养基中培养 三天；以及（2-5)向所得到的培养物中添加 Wnt抑制剂IWR-I (5mM;Enzo Life Sciences) 后继续培养4天，以便获得所述心肌细胞。由此可以显著提高获得心肌细胞的效率。
[0014] 在本发明的另一方面，本发明提供了一种心肌细胞。根据本发明的实施例，所述心 肌细胞是通过前面所述的方法构建的。
[0015] 在本发明的再一方面，本发明提供了前面所述的心肌细胞在筛选药物中的用途， 所述药物用于治疗LQT疾病，优选JLNS型LQT疾病。发明人发现，本发明的心肌细胞保留 LQTS的基因型，心肌细胞表现出的特性与患者的临床特征相吻合，通过使所述心肌细胞与 药物接触，能够有效筛选用于治疗LQT疾病，特别是JLNS型LQT疾病的药物。具体的，根据 本发明的实施例，将候选化合物与根据本发明实施例的心肌细胞接触，并且检测与候选化 合物前后，心肌细胞的动作电位时程的延长，如果接触后动作电位时程明显的延长得到明 显改善，则说明该候选化合物可以用于治疗LQT疾病。利用该方法，发明人验证了目前所使 用的exiletine满足上述筛选要求。
[0016] 在本发明的又一方面，本发明提供了一种制备诱导多能干细胞的方法。根据本发 明的实施例，该方法包括：（1)利用附着体载体，将重编程因子编码基因引入体细胞；以及 (2)在适于体细胞重编程的条件下，对步骤（1)中得到的细胞进行培养，以便获得诱导多能 干细胞。发明人发现，利用本发明的该方法能够快速有效地