对氧磷酶1基因的表达纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程和蛋白工程技术领域，具体涉及对氧磷酶I基因的表达纯化方法。
【背景技术】
[0002]对氧磷酶I (paraoxonasel, PONI)在研究有机磷中毒预防和治疗方面具有重要作用，但目前天然PONl很难获得，利用大肠杆菌表达的PONl虽然廉价且生产周期短，但获得的蛋白因缺少糖基化及磷酸化修饰，在体内应用时存在免疫排斥，半衰期短，易降解等问题。
[0003]目前虽然也有通过基因工程方法表达出具有活性的PONl基因的报道，但未能得到纯化的重组蛋白，也就没有比较完善的对氧磷酶I的表达纯化方法。
【发明内容】
[0004]为了解决现有技术中表达、纯化具有活性的PONl基因困难的问题，本发明提供了一种对氧磷酶I基因的表达纯化方法。
[0005]本发明的对氧磷酶I基因的表达纯化方法，步骤如下:
(1)扩增对氧磷酶I基因，连接到转移载体pFastBaC?l上构建重组转移载体，重组转移载体转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，获得含有对氧磷酶I基因的重组杆状病毒DNA，将重组杆状病毒DNA转染家蚕BmN细胞使其在细胞内复制装配成含对氧磷酶I基因的重组病毒;
(2)步骤(I)的重组病毒接种家蚕五龄幼虫，发病后取蚕血，经离心过滤除杂并经浓缩后用汽巴蓝亲和层析以及抗体亲和层析纯化蚕血，获得对氧磷酶I蛋白。
[0006]优选地，上述对氧磷酶I基因的表达纯化方法中，步骤(I)所述扩增使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO: Γ2所示。
[0007]优选地，上述对氧磷酶I基因的表达纯化方中，步骤(2)所述离心为4°C条件下以10000 rpm的转速离心30 min ;所述过滤除杂是采用9层医用纱布过滤后再经过0.45 μ m滤膜；所述浓缩是用10 kD超滤管进行。
[0008]优选地，上述对氧磷酶I基因的表达纯化方法中，步骤(2)所述汽巴蓝亲和层析使用的固定相为汽巴蓝琼脂糖-3GA3000-CL。
[0009]优选地，上述对氧磷酶I基因的表达纯化方法中，步骤(2)所述抗体亲和层析所用抗体是通过原核表达的对氧磷酶I基因四次免疫新西兰雄兔后取血然后通过ProteinA纯化制得。
[0010]本发明的有益效果:通过设计引物,构建重组病毒vBm-Z^W/，将其接种家蚕五龄幼虫，使其表达目的蛋白PONl，通过汽巴蓝亲和层析和抗体亲和层析纯化得到了纯度较高的PONl。此方法解决了天然PONl含量低，纯化难得问题，为以后研究PONl功能奠定基础。
【附图说明】
[0011]图1为重组转移载体pFastBacTMl-ZYW/的双酶切-PCR鉴定图M:DNA laddermarker ；1:双酶切产物；2:PCR产物。
[0012]图 2 为重组 Bacmid-ZYW/ 的 PCR 鉴定图；M.DNA ladder marker, 1.PONl F/P0N1RPCR 产物，2.PONl F/M13R PCR 产物，3.M13F/P0N1R PCR 产物，4.M13F/M13R PCR 产物。
[0013]图3为重组杆状病毒BmNPV-Z^W/在家蚕五龄幼虫中表达产物的SDS-PAGE图，M.蛋白质低分子质量标记，1.接种野生病毒的蚕血，2.接种重组病毒的蚕血。
[0014]图4为重组杆状病毒BmNPV-Z^W/在家蚕五龄幼虫中表达产物的Westernblotting鉴定图，Μ.蛋白质低分子质量标记，I’.接种野生病毒的蚕血，2’.接种重组病毒的蚕血。
[0015]图5为纯化蚕血的SDS-PAGE鉴定图，Μ.:蛋白质低分子质量标记，1:接种野生病毒的蚕血,2:接种重组病毒的蚕血原样，3:汽巴蓝亲和层析柱初步纯化的蚕血，4:抗体亲和层析柱进一步纯化的蚕血。
[0016]图6为纯化蚕血的Western blotting鉴定图，Μ.:蛋白质低分子质量标记，I’:接种野生病毒的蚕血，2’:接种重组病毒的蚕血原样，3’:汽巴蓝亲和层析柱初步纯化的蚕血，4’:抗体亲和层析柱进一步纯化的蚕血。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0018]生物材料及试剂来源:
pFastBac?l载体购自Invitrogen公司，限制性内切酶及?07? I和ZSo I购自Fermentas公司，连接酶Ligat1n high购自Fermentas公司，大肠杆菌TGl感受态细胞和大肠杆菌DHlOBac感受态细胞购自Fermentas公司，Sf_900 II SFM(IX)无血清培养基购于美国GIBCO公司，胎牛血清(FBS)购于奥地利PAA公司。本实施例中的家蚕BmN细胞和家蚕五龄幼虫由上海生化所吴祥甫老师惠赠，公众可在市面购买同类商品，本发明申请人也可以提供，不会影响发明目的的实现。
[0019]实施例1:重组转移载体pFastBacTMl-ZYW/的构建
根据对氧磷酶I基因特性，设计引物F和R，以家蚕总RNA为模板进行逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，F和R为引物，进行PCR扩增。
[0020]h游引物 F: 5’ -CCGGAATTCATGGCTAAACTGACAGCG-3，(SEQ ID N0:1),其中下划线为EC。》I酶切位点；
下游引物 R:5’-CCGCTCGAGCTACAGCTCACAGTAAAG-3’ (SEQ ID NO: 2)，下划线为ZAo I 酶切位点。
[0021]扩增程序为:95°C预变性5min，95°C变性45s，59°C退火30s，72°C延伸lmin，循环30次；最后72°C延伸8min，回收产物，得到对氧磷酶I (PONl)基因。
[0022]将PONl基因及pFastBac?l载体分别用EcoR I和沿ο I同时进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物；将回收的PONl基因片段用Ligat1n high连接酶连接到经酶切的pFastBacTMl载体上，使PONl基因位于多角体启动子控制之下，构建转移载体pFastBac?l-PONl，转化大肠杆菌TGl感受态细胞，常规方法筛选阳性克隆，将该重组转移载体进行PCR与双酶切，产物进行琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如图1所示，I号泳道双酶切产物出现两条亮带，其中一条为1065bp的PONl基因片段，另一条为质粒酶切后片段；2号泳道中的亮带为1065bp的PONl基因片段的PCR产物，琼脂糖凝胶电泳初步鉴定质粒构建成功，然后送去测序，经测序知其序列如SEQ ID N0:3所示，目的基因已成功克隆到pFastBac?l 载体上。
[0023]实施例2:家蚕重组杆状病毒vBm-PONl的构建 (I)重组杆状病毒DNA (Bacmid-PONl)的获得
将实施例1构建好的重组转移载体pFastBacTMl-PONl转化到大肠杆菌DHlOBac感受态细胞中，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，分别以M13上下游引物、PONl上下游、M13下游引物和PONl上游引物以及M13上游引物和PONl下游引物四组引物对，进行 PCR 鉴定，其中 M13F:5 ' -CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3 ' (SEQ ID NO:4) ；M13R:5' -AGCGGATAACAATTTTCACACAGG-3' (SEQ ID NO: 5)，取少量 PCR 产物进