一种双酶提高γ-环糊精产率的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品技术领域，尤其是涉及一种采用双酶法提高γ-环糊精产率的方法。
【背景技术】
[0002]环糊精是由芽孢杆菌属的某些种产生的葡萄糖基转移酶作用于淀粉而生成的一类环状低聚糖。环糊精最显著的特征是具有一个环外亲水、环内疏水且有一定尺寸的立体手性空腔，因而可以包埋一些疏水性的分子或者基团。γ-环糊精是由8个D-吡喃型葡萄糖单元通过α-1，4-糖苷键链接而成的。与α、β环糊精相比，γ-环糊精具有较大的疏水性空腔、较高的溶解度，能包接较大的分子，因此在食品、医疗行业有着较广泛的应用空间。
[0003]然而，到目前为止，在市场上研宄最广泛的是环糊精和较小范围的α-环糊精，但γ-环糊精在国内尚未有工业化生产，主要是因为其低产率、高成本导致的高价格限制了其使用。大多数的CGTase作用淀粉生成的产物中大多数为α、β、γ三种环糊精的混合物，只产生某种特定类型的环糊精很少。现在大多采用基因工程的方法来提高CGTase的产物专一性，同时通过控制反应的条件对改善环糊精的产率也非常重要，比如反应的pH、温度、底物浓度等。或者有人通过向体系中加入普鲁兰酶或者异淀粉酶同时和CGTase共同作用提高了环糊精的产率。而普鲁兰酶的价格相对来说较昂贵。本发明采用4 a GTase和CGTase双酶法催化淀粉合成环糊精，目前未见相关报道。
【发明内容】
[0004]针对现有技术存在的上述问题，本发明人提供了一种双酶提高γ-环糊精产率的方法。本发明解决了 Y-环糊精产率低的问题，进而扩大其应用范围。
[0005]本发明的技术方案如下：
[0006]一种双酶提高γ -环糊精产率的方法，包括以下步骤：
[0007](I)以玉米淀粉为底物，微波加热使其完全溶解于pH为8. 5、浓度为50mmol/l的Tris-Hcl缓冲溶液中，得到玉米淀粉溶液；
[0008](2)取玉米淀粉溶液，向其中分别加入4 a GTase和CGTase两种酶，控制反应温度和反应时间，反应结束后，沸水煮沸灭酶30min ；
[0009](3)向反应液加入葡萄糖淀粉酶，38°C条件下反应16_24h，反应结束后煮沸灭酶IOmin, IOOOOrpm 离心 5min ；
[0010](4)上清液即为含Y -环糊精的混合物。
[0011]所述双酶为4 a GTase 和 CGTase ;其中 4 a GTase 是来自于 thermus acquaticus 的一种糖基转移酶，CGTase是来自于alkalophilic bacillus 825-6的一种环糊精糖基转移酶。
[0012]步骤⑴中所述玉米淀粉溶液的浓度为I?5%。
[0013]步骤（2)中酶的添加方式为先加4 a GTase，后加CGTase。
[0014]步骤⑵中加入4α GTase后反应温度为65-70 °C，反应时间为12_24h;加入CGTase后反应温度为50°C，反应时间为24h。
[0015]步骤（2)中4 a GTase和CGTase两种酶的用量范围分别为：0. 1U-0. 5U/g淀粉。
[0016]步骤（3)中葡萄糖淀粉酶的用量范围为：0. 1-0. 5U/g淀粉。
[0017]本发明有益的技术效果在于：
[0018]利用4 a GTase耐高温且能够催化淀粉产生大环糊精的特性，将4 a GTase与CGTase相结合，采用双酶法催化淀粉制备环糊精，使其产率比单酶催化法提高了两倍以上。
【附图说明】
[0019]图I和图2分别为单酶法和双酶法对γ -环糊精产率的影响；
[0020]其中，图I是CGTase催化玉米淀粉后Y _环糊精含量测定的高效阴离子色谱(HPAEC)图；
[0021]图2是实施例3中4 a GTase和CGTase共同催化玉米淀粉后γ -环糊精含量测定的HPAEC图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图，对本发明进行具体描述。
[0023]本发明所米用的双酶为4a GTase和CGTase ;其中4 a GTase是来自于thermusacquaticus 的一种糖基转移酶，CGTase 是来自于 alkalophilic bacillus 825-6 的一种环糊精糖基转移酶。酶的来源为市售。
[0024]实施例I
[0025](I)将淀粉溶于50ml的pH8. 5的浓度为50mmol/l的Tris-Hcl缓冲液中，配置I %的淀粉溶液，微波加热2-3min使其糊化。
[0026](2)取⑴中配置好的溶液1ml，先加入O. lU/g淀粉的4 a GTase在70°C下反应24h预处理玉米淀粉，之后再向反应体系中加入O. 5U/g淀粉CGTase在50°C下反应24h。
[0027](3)将步骤⑵中的反应液煮沸灭活30min。
[0028](4)取步骤（3)中的反应液500ul和500ul O. 2M pH4. 2的醋酸钠缓冲溶液混合，并向其中加入O. 4U/g淀粉的葡萄糖淀粉酶在38°C下反应16h。
[0029](5)将步骤⑷所得的反应液煮沸IOmin灭酶，灭酶后IOOOOrpm离心5min。
[0030](6)取上清液用高效阴离子色谱进行产物分析。
[0031](7)经测定，γ-环糊精产率为6.7%。
[0032]实施例2
[0033](I)将淀粉溶于50ml的pH8. 5的浓度为50mmol/l的Tris-Hcl缓冲液中，配置3%的淀粉溶液，微波加热2-3min使其糊化。
[0034](2)取⑴中配置好的溶液1ml，先加入O. lU/g淀粉的4 a GTase在70°C下反应24h预处理玉米淀粉，之后再向反应体系中加入O. 5U/g淀粉CGTase在50°C反应24h。
[0035](3)将步骤⑵中的反应液煮沸灭活30min。
[0036](4)取步骤（3)中的反应液500ul和500ul O. 2M pH4. 2的醋酸钠缓冲溶液混合，并向其中加入O. 4U/g淀粉的葡萄糖淀粉酶在38°C下反应16h。
[0037](5)将步骤⑷所得的反应液煮沸IOmin灭酶，灭酶后IOOOOrpm离心5min。
[0038](6)取上清液用高效阴离子色谱进行产物分析。
[0039](7)经测定，γ -环糊精产率为9. 8%。
[0040]实施例3
[0041](I)将淀粉溶于50ml的pH8. 5的浓度为50mmol/l的Tris-Hcl缓冲液中，配置5%的淀粉溶液，微波加热2-3min使其糊化。
[0042](2)取⑴中配置好的溶液1ml，先加入O. 2U/g淀粉的4 a GTase在70°C下反应24h预处理玉米淀粉，之后再向反应体系中加入O. 5U/g淀粉CGTase在50°C反应24h。
[0043](3)将步骤（2)中的反应液煮沸灭活30min。
[0044](4)取步骤（3)中的反应液500ul和500ul O. 2M ρΗ4· 2的醋酸钠缓冲溶液混合，并向其中加入O. 4U/g淀粉的葡萄糖淀粉酶在38°C下反应16h。
[0045](5)将步骤（4)所得的反应液煮沸IOmin灭酶，灭酶后IOOOOrpm离心5min。
[0046](6)取上清液用高效阴离子色谱进行产物分析。
[0047](7)经测定，γ -环糊精产率为13. I %。
[0048]对比例：
[0049](I)将淀粉溶于50ml的ρΗ8· 5的浓度为50mmol/l的Tris-Hcl缓冲液中，配置I %的淀粉溶液，微波加热2-3min使其糊化。
[0050](2)取⑴中配置好的溶液1ml，向反应体系中加入O. 5U/g淀粉CGTase在50°C反应 24ho
[0051](3)将步骤（2)中的反应液煮沸灭活30min。
[0052](4)取步骤（3)中的反应液500ul和500ul O. 2M pH4. 2的醋酸钠缓冲溶液混合，并向其中加入O. 4U/g淀粉的葡萄糖淀粉酶在38°C下反应16h。
[0053](5)将步骤⑷所得的反应液煮沸IOmin灭酶，灭酶后IOOOOrpm离心5min。
[0054](6)取上清液用高效阴离子色谱进行产物分析。
[0055](7)经测定，γ -环糊精产率为3. 2%。
[0056]从图I和图2 (图2是实施例3的结果）可以看到，采用4 a GTase和CGTase相结合的方法，催化玉米淀粉，制备γ -环糊精，使γ -环糊精的产率比单一 CGTase催化提高了4倍以上。
【主权项】
1.一种双酶提高γ-环糊精产率的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)以玉米淀粉为底物，微波加热使其完全溶解于pH为8.5、浓度为50mmol/l的Tris-Hcl缓冲溶液中，得到玉米淀粉溶液； (2)取玉米淀粉溶液，向其中分别加入4a GTase和CGTase两种酶，控制反应温度和反应时间，反应结束后，沸水煮沸灭酶30min ； (3)向反应液加入葡萄糖淀粉酶，38°C条件下反应16-24h，反应结束后煮沸灭酶lOmin, 1000rpm 离心 5min ； (4)上清液即为含γ-环糊精的混合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述双酶为4a GTase和CGTase ;其中4 a GTase是来自于thermus acquaticus的一种糖基转移酶，CGTase是来自于alkalophilic bacillus 825-6的一种环糊精糖基转移酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)中所述玉米淀粉溶液的浓度为I ?5% ο
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中酶的添加方式为先加4a GTase,后加 CGTase0
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中加入4a GTase后反应温度为65-70°C，反应时间为12-24h ;加入CGTase后反应温度为50°C，反应时间为24h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中4a GTase和CGTase两种酶的用量范围分别为:0.1U-0.5U/g淀粉。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中葡萄糖淀粉酶的用量范围为:.0.1-0.5U/g 淀粉。
【专利摘要】一种双酶提高γ-环糊精产率的方法，包括以下步骤：(1)以玉米淀粉为底物，微波加热使其完全溶解于pH为8.5、浓度为50mmol/l的Tris-Hcl缓冲溶液中，得到玉米淀粉溶液；(2)取玉米淀粉溶液，向其中分别加入4αGTase和CGTase两种酶，控制反应温度和反应时间，反应结束后，沸水煮沸灭酶30min；(3)向反应液加入葡萄糖淀粉酶，38℃条件下反应16-24h，反应结束后煮沸灭酶10min，10000rpm离心5min；(4)上清液即为含γ-环糊精的混合物。本发明解决了γ-环糊精产率低的问题，进而扩大其应用范围。
【IPC分类】C12P19-20, C12P19-04, C12P19-18
【公开号】CN104726522
【申请号】CN201510176752
【发明人】王金鹏, 李林林, 张梦柯, 周星, 赵建伟, 杨哪, 谢正军, 徐学明, 金征宇, 焦爱权, 田耀旗, 吴凤凤
【申请人】江南大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年4月14日