一种快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种快速检测鲜乳中沙门氏菌的方 法。
【背景技术】
[0002] 食品安全关系国计民生，食源性疾病和食品污染仍然是危害公众健康的重要因 素，是当今世界最为关注的公共安全问题，据统计在世界各国的细菌性食物中毒中，沙门氏 菌引起的食物中毒常列榜首。对2001-2010年中国食源性疾病暴发情况进行统计分析表 明，微生物污染引发的食源性疾病占总体的56. 39%，沙门氏菌引发的食源性疾病占总体的 10%。沙门氏菌属（Salmonella)是一群抗原构造、生化性状相似的革兰氏阴性杆菌，由沙门 氏菌引起的中毒主要以急性肠胃炎为主，潜伏期一般为4~48小时，主要症状有呕吐、腹 泻、腹疼、惊厥、抽搐和昏迷。
[0003] 鲜乳是人们喜欢的食用营养品，营养丰富，是人体钙的最佳来源，但鲜乳极容易受 沙门氏菌污染而变质，污染来源于乳畜本身及生产加工的各个环节，从而影响消费者饮食 安全和健康。
[0004] 目前鲜乳中沙门氏菌的检测方法，还主要依赖于传统的微生物学检测方法。传统 的沙门氏菌检测法需要经过前增菌、增菌、分离培养、生化试验确认等试验步骤，至少4-7 天才能得出明确的诊断结果，操作步骤繁琐、费时，而且只能检测25g/ml样品中存活的沙 门氏菌，检出率较实际样品中的沙门氏菌低，极易出现假阴性结果，危害广大消费者安全。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对鲜乳中的沙门氏菌提供了一种快速检测方法。
[0006] 基于以上目的，本发明采取了以下技术方案： 一种快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法，包括以下步骤： 1) 将鲜乳样品加入到缓冲液中得到鲜乳混合液，所述缓冲液中含有去除蛋白质和脂肪 的试剂，初步去除鲜乳样品中的蛋白质和脂肪； 2) 对鲜乳混合液进行滤纸过滤，再次去除鲜乳混合液中的蛋白质和脂肪，增加流动性， 均匀分散滤液，取滤液进行微孔滤膜抽滤，分离微生物； 3) 将步骤2)中过滤后的微孔滤膜剪碎，添加四硫磺酸钠煌绿增菌液和磷酸盐缓冲液进 行冲洗浸泡，得到菌悬液； 4) 向菌悬液中添加沙门氏菌免疫磁珠进行混合，振荡、静置磁力架上分层，弃上清； 5) 取下层溶液，加入磷酸盐缓冲液洗涤，静置磁力架上分层，弃上清，得到浓缩待测 液； 6) 采用Elisa检测法进行检测即可。
[0007] 步骤2)中对鲜乳混合液进行滤纸过滤后，取滤液进行离心，收集下清液，微孔滤膜 抽滤。
[0008] 步骤1)中所述试剂为纤维素树脂。
[0009] 步骤1)中所述缓冲液为0.0 lmol/L磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液)。
[0010] 所述微孔滤膜孔径为〇. 22 μ m。
[0011] 步骤3)中所述冲洗浸泡时间< 2min，所述四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB增菌液)和 磷酸盐缓冲液体积比为1 :1。
[0012] 步骤4)中振荡温度为37°C，振速为40rpm，振荡时间为30min，使菌悬液中的沙门 氏菌与沙门氏菌免疫磁珠结合。
[0013] 步骤4)中所述静置时间为3min。
[0014] 步骤5)中加入的磷酸盐缓冲液与菌悬液体积比为1 :1。
[0015] 本发明有益效果： 1、 本发明采用含有纤维素树脂的PBS缓冲液处理鲜乳样品，能够温和去除鲜乳中的蛋 白质和脂肪同时，有效保护沙门氏菌； 2、 采用滤纸初过滤和微孔滤膜抽滤相结合，去除鲜乳样品中的脂肪和蛋白质后，将鲜 乳样品中的沙门氏菌等细菌富集到微孔滤膜上，增大了沙门氏菌的检出率，解决了低水平 的病原微生物的检测问题； 3、 采用TTB增菌液和PBS缓冲液作为洗脱缓冲液，TTB增菌液可有效的选择性保护沙 门氏菌，有利于沙门氏菌被洗脱后在少量溶液的环境中保存和生长； 4、 鲜乳样品前处理后，采用免疫磁珠富集分离方法和Elisa检测法相结合，检测鲜乳 中沙门氏菌的时间总共约为50min，而国标方法所需检测时间4-7，与国标方法相比，本发 明检测时间大大缩短。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1筛选试验 1. 1鲜乳样品缓冲液的选择 取25mL鲜乳沙门氏菌阳性样品4份，分别加入装有225mL缓冲液的均质袋中，均质袋 中缓冲液分别为：ddH20、0.0 lmol/L PBS缓冲液（pH7. 4,下同）、碳酸盐缓冲液、缓冲蛋白胨 水（BPW)。然后按照传统的沙门氏菌检测方法，对上述鲜乳混合液进行增菌、划线分离、生化 试验等，试验结果如表1所示。
[0017]
【主权项】
1. 一种快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将鲜乳样品加入到缓冲液中得到鲜乳混合液，所述缓冲液中含有去除蛋白质和脂肪 的试剂； 2) 对鲜乳混合液进行滤纸过滤，取滤液进行微孔滤膜抽滤； 3) 将步骤2)中过滤后的微孔滤膜剪碎，添加四硫磺酸钠煌绿增菌液和磷酸盐缓冲液进 行冲洗浸泡，得到菌悬液； 4) 向菌悬液中添加沙门氏菌免疫磁珠进行混合，振荡、静置磁力架上分层，弃上清； 5) 取下层溶液，加入磷酸盐缓冲液洗涤，静置磁力架上分层，弃上清，得到浓缩待测 液； 6) 采用Elisa检测法进行检测即可。
2. 根据权利要求1所述快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法，其特征在于，步骤2)中对鲜 乳混合液进行滤纸过滤后，取滤液进行离心，收集下清液，微孔滤膜抽滤。
3. 根据权利要求2所述快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法，其特征在于，步骤1)中所述 试剂为纤维素树脂。
4. 根据权利要求3所述快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法，其特征在于，步骤1)中所述 缓冲液为〇. 〇lmol/L磷酸盐缓冲液。
5. 根据权利要求4所述快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法，其特征在于，所述微孔滤膜 孔径为0. 22ym。
6. 根据权利要求5所述快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法，其特征在于，步骤3)中所述 冲洗浸泡时间< 2min，所述四硫磺酸钠煌绿增菌液和磷酸盐缓冲液体积比为1 :1。
7. 根据权利要求6所述快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法，其特征在于，步骤4)中振荡 温度为37°C，振速为40rpm，振荡时间为30min。
8. 根据权利要求7所述快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法，其特征在于，步骤4)中所述 静置时间为3min。
9. 根据权利要求8所述快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法，其特征在于，步骤5)中加入 的磷酸盐缓冲液与菌悬液体积比为1 :1。
【专利摘要】一种快速检测鲜乳中沙门氏菌的方法，属于微生物检测技术领域，包括以下步骤：将鲜乳样品加入到缓冲液中得到鲜乳混合液，所述缓冲液中含有去除蛋白质和脂肪的试剂；对鲜乳混合液进行滤纸过滤，取滤液进行微孔滤膜抽滤；将过滤后的微孔滤膜剪碎，添加四硫磺酸钠煌绿增菌液和磷酸盐缓冲液进行冲洗浸泡，得到菌悬液；向菌悬液中添加沙门氏菌免疫磁珠进行混合，振荡、静置磁力架上分层，弃上清；取下层溶液，加入磷酸盐缓冲液洗涤，静置磁力架上分层，弃上清，得到浓缩待测液；采用Elisa检测法进行检测即可。本发明方法检测鲜乳中沙门氏菌的时间总共约为50min，与国标方法相比，检测时间大大缩短。
【IPC分类】C12R1-42, C12Q1-10, G01N33-569
【公开号】CN104726534
【申请号】CN201510195909
【发明人】王永, 王法云, 朱海华, 王慧, 周莉, 章建军, 邱红玲, 关炳峰, 谭静, 平洋
【申请人】河南省商业科学研究所有限责任公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年4月23日