一种筛选杀菌剂的培养基及其筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种杀菌剂的筛选方法，具体涉及以一种真菌杀菌剂药效快速评价方 法。
【背景技术】
[0002] 常用的防治园艺植物真菌药剂筛选方法较多，如离体测定法、果实采后药剂处理 法、果园施药法等；这些方法不会漏掉有希望的化合物，就是操作繁锁、筛选成本高、受季节 性限制，使药剂筛选的准确性和效率难以提高。采用菌丝生长速率法，筛选出能有效抑制菌 丝生长化学药剂种类及适宜浓度，为该病害田间药剂有效防治提供了依据。然而，对于杀菌 剂药效的评价，尚缺乏快速、简便、有效的方法。
[0003] 目前真菌杀菌剂的室内筛选多采用菌丝生长速率法，此方法存在以下缺点：
[0004] (1)含药培养基的制备。对于一些不耐高温的杀菌剂，因要求培养基温度低再加入 药剂，倒平板时，出现培养面不平，导致试验结果不准确。
[0005] (2)药剂浓度准确度。一方面在添加药剂的量，还要对培养基进行量化；另一方面 需要考虑培养基中水份的含量，对药剂含量计算带来许多麻烦。
[0006] (3)药剂致死剂量条件下，无法区分药剂的药效。
[0007] (4)无法区分药剂的渗透扩散效果。
[0008] 为此，发明人对防治梨树腐烂病药剂的筛选方法进行了改进，通过平板打孔，加入 药剂，以期为大规模药剂筛选提供一个准确、可靠、取材容易、方法简便、不受季节限制的新 方法。
【发明内容】
[0009] 本发明一方面提供一种用于筛选杀菌剂的培养基，其特征在于，其制备方法是将 微生物培养基，置于培养容器中，在培养基上的一个位置注入待筛选的杀菌剂，另一个位置 用来接种菌丝块。
[0010] 优选地，所述培养容器中微生物培养基的表面是平的。
[0011] 优选地，所述微生物培养基为细菌培养基或者真菌培养基；优选真菌培养基；更 优选PDA培养基。
[0012] 优选地，所述一个位置和另一个位置之间的距离固定，优选为40mm、60mm和80mm， 优选40mm或60mm。
[0013] 优选地，所述培养容器是培养皿；优选直径为90mm的培养皿。
[0014] 优选地，所述两点位于培养皿中轴线上，中心两侧各选取一点。
[0015] 优选地，所述PDA培养基中琼脂的浓度为15g/L。
[0016] 本发明另一方面提供一种筛选杀菌剂的方法，包括（1)在无菌培养容器选取 两点，两点之间的距离为D ; (2)在无菌条件下，于培养容器中倒入微生物培养基，凝固 后，在上述任选一点处打孔；（3)在无菌条件下，往培养基打孔处，注入杀菌剂，另一点处 接种菌丝块，置于恒温培养箱中培养；(4)定期观察、测量并记录菌丝扩展距离dn(η = 1， 2, 3 · · · · ) 〇
[0017] 优选地，恒温培养箱的温度为20-30 °C，优选25 °C，
[0018] 抑菌率（％ ) = (D-dnV(D) X100%。
[0019] 优选地，每隔ld(24h)观察记录一次，测量菌丝扩展距离，记作dn(n = 1， 2, 3 · · · · ) 〇
[0020] 优选地，其中所述的培养容器为培养皿；所述两点位于培养皿中轴线上，中心两侧 各选取一点。
[0021] 优选地，所述 D 为 40mm、60mm 和 80mm，优选 40mm、60mm。
[0022] 优选地，培养皿的直径为90mm。
[0023] 优选地，当D = 40mm时，测量并记录经过Id (24h) (1天）培养后的菌丝扩展距离； 以及测量并记录经过nd(24nh) (η天）培养后的菌丝扩展距离（η = 1，2, 3 · · · ·)。
[0024] 优选地，当D = 60mm时，测量并记录经过2d(48h)(两天）培养后的菌丝扩展距离； 以及测量并记录经过nd(24nh) (η天）培养后的菌丝扩展距离（η = 1，2, 3 · · · ·)。
[0025] (1)当 D = 40mm 时，抑菌率（％) = (D-ClnV(D-Cl1) X 100% 〇
[0026] (2)当 D = 60mm 时，抑菌率（％ ) = (D-dnV(D-d2) X100%。
[0027] 优选地，所述微生物培养基为细菌培养基或者真菌培养基；优选真菌培养基；更 优选PDA培养基。
[0028] 优选地，所述PDA培养基中琼脂的浓度为15g/L。
[0029] 具体的，所述筛选杀菌剂的方法包括：
[0030] 1、培养皿处理：在培养皿（无菌）中轴线上，中心两侧选取各选取一点，两点间距 离为D，直径90mm的培养皿，D取值40mm或60mm〇
[0031] 2、倒平板：在无菌条件下，于各培养皿中倒入约20mlPDA培养基，凝固后，使用直 径5_的打孔器，在培养皿背面确定好的两个点，任选一点垂直打孔并取出培养基，放置备 用。
[0032] 3、接菌和加药：无菌条件下，往培养基打孔处，注入30微升配制好的药剂，另一个 位置接种菌丝块，置于恒温培养箱25°C培养。
[0033] 4、观察测量：每隔ld(24h)观察记录一次，测量菌丝扩展距离，记作dn(n = 1， 2, 3 · · · · ) 〇
[0034] 5、抑菌率计算：当 D = 40mm 时，抑菌率（％) = (D-ClnV(D-Cl1) XlOO % ;当 D = 60mm 时，抑菌率（％) = (D-dnV(D-d2)X100%〇
[0035] 根据抑菌率作差异显著性分析，进行杀菌剂药效评价。
[0036] 通过与菌丝生长速率法实验的比较，本发明的方法能够更好的凸显药剂之间的差 异显著性。同时，在具体操作上也具有其他方法不可比拟的优点。首先，试验中不需要制备 含药培养基。含药培养基制备复杂，易出现错误，改良后的方法操作更加简单，也避免了制 备过程中出现的操作误差。其次，滤纸片法在试验中由于滤纸中药剂不足，难以观察到抑制 效果，需要在中途添加药剂，容易污染培养基，而该方法在试验过程中无需多余操作，可以 直观的看到药剂抑制真菌的整个过程。最后，与类似的杯碟法相比，无需使用杯碟，减少了 材料的使用，经济实用。
[0037] 通过试验，本方法简单有效。同时，我们也在试验中发现了该方