Nfyap1基因及其表达产物的应用

文档序号:8407687阅读:1479来源:国知局
Nfyap1基因及其表达产物的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因的应用,特别是涉及一种NFYAPl基因及其表达产物的应用。
【背景技术】
[0002] 肝癌严重威胁着我国人民的生命健康。肝癌的诊断,尤其早期诊断是临床诊疗和 预后的关键。目前,在我国肝癌的定性诊断仍以检测血清AFP (甲胎蛋白)为主,呈现如下 特点:60%以上的肝癌病例血清AFP > 400 μ g/L ;目前还没有其他肿瘤标志物的特异性可 与AFP相媲美;AFP检测较少依赖影像学设备和新技术。AFP是目前全球应用最为广泛的肝 癌肿瘤标志物,已经应用了数十年,其敏感性为40%~65%,特异性为76%~96%,如此的敏 感性和特异性均不令人满意。因此,发现灵敏度和特异性高的新的肿瘤标志物将是提高肝 癌早期诊断水平的关键。除AFP外,近年来用于肝癌检测的其他血清标志物还包括:甲胎 蛋白异质体、Y-谷氨酰转肽酶同工酶II (GGT- II)、碱性磷酸酶同工酶I、醛缩酶同工酶A (ALD-A)、岩藻糖苷酶(AFU)、抗胰蛋白酶I、异常凝血酶原、铁蛋白与酸性铁蛋白等。AFP异 质体和异常凝血酶原的应用提高了肝癌患者的检出率,但早期诊断和指导个性化治疗的分 子分型诊断仍是我们面临的极大挑战。一般认为以下四类生物分子常作为原发性肝癌标志 物:①癌胚和糖蛋白抗原;②酶和同工酶;③细胞因子;④基因。
[0003] 然而,关于人NFYAPl基因在肿瘤的表达谱及与肿瘤发生的关系尚不清楚,有待进 一步研究。

【发明内容】

[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种NFYAPl基因及其表达产物的应用,使肝癌 诊断更加准确、快速。
[0005] 为解决上述技术问题,本发明提供了一种NFYAPl基因及其表达产物在制备诊断 肝癌的产品中的应用。
[0006] 所述诊断肝癌的产品包括:用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或基因 芯片诊断肝癌的产品。
[0007] 在本发明中,所述用RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增NFYAPl基因 的引物。
[0008] 所述用实时定量PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增NFYAPl基因的引物。 其中,用于制备用RT-PCR或实时定量PCR诊断肝癌产品中的一对特异扩增NFYAPl基因的 引物,所述引物的上游引物序列具有如SEQ ID NO. 1所示的序列或其互补序列,所述引物对 的下游引物序列具有如SEQ ID NO. 2所示的序列或其互补序列。
[0009] 所述用免疫检测诊断肝癌的产品包括:与NFYAPl蛋白特异性结合的抗体,包括多 克隆抗体和单克隆抗体。
[0010] 所述用原位杂交诊断肝癌的产品包括:与NFYAPl基因的核酸序列杂交的探针。
[0011] 所述用基因芯片诊断肝癌的产品包括:与NFYAPl基因的核酸序列杂交的探针。
[0012] 在本发明中,可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对NFYAPl蛋白特异的 抗体。例如,将提纯的人NFYAPl基因产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗 体。同样,表达人NFYAPl蛋白或它的抗原的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。根 据本发明制备的抗体可以是单克隆抗体,这些单克隆抗体可用杂交瘤及时制备。本发明的 抗体包括可以阻抑NFYAPl功能的抗体,也可以是不影响人NFYAPl功能的抗体。每一类抗 体都可以通过对人NFYAPl基因产物的片段或功能域致免疫而产生,而人NFYAPl基因产物 及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的NFYAPl基因产 物结合的抗体,可以利用在原核细胞例如E. coli中产生的基因产物来免疫动物而得到。与 翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化NFYAPl蛋白或多肽结合的抗体,可以利用在真核细胞 如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到。
[0013] 在本发明中,所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其他衍生物。所述 探针的长度没有限制,只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合,任何长度都可 以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样,所述探针的长度可长至 60、80、100、150、300个碱基对或更长,甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信 号特异性有不同的影响,所述探针的长度通常至少是14个碱基对,最长一般不超过30个碱 基对,与目的核苷酸序列互补的长度以15~25个碱基对最佳。所述探针自身互补最好少 于4个碱基对,以免影响杂交效率。
[0014] 本发明实验证实NFYAPl基因在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织,因此, NFYAPl基因及其表达产物(蛋白产物)可作为诊断肝癌的特异性标志基因,使肝癌诊断更加 准确、快速。
【附图说明】
[0015] 下面结合附图与【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明:
[0016] 图1是RT-PCR检测NFYAPl基因在20例肝癌病人中癌旁组织及癌组织中的表达 情况,其中,N指癌旁组织,C指肝癌组织。
【具体实施方式】
[0017] 以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具 体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建 议的条件。
[0018] 实施例1RT-PCR实验检测NFYAPl基因在肝癌组织中的表达情况
[0019] RT-PCR 是指将逆转录(Reverse Transcription ;RT)反应和 PCR (Polymerase Chain Reaction)反应组合在一起的方法。RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合 在一起,提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或 定量。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及Sl核酸酶分析在内 的RNA分析技术,更灵敏,更易于操作。RT-PCR的模板可以为总RNA或poly (A)选择性RNA。 逆转录反应可以使用逆转录酶,以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物起始。RT-PCR 可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中,每一步都在最佳条件下进行。cDNA 的合成首先在逆转录缓冲液中进行,然后取出1/10的反应产物进行PCR。
[0020] 1、组织分离
[0021] 实验用组织来源于原发性肝癌的手术病人。手术切除的肝脏一经离体,迅速切取 病灶及周围5公分外癌旁组织,放入液氮中(-80°C)保存。癌和癌旁的诊断均以病理诊断 为最终依据。
[0022] 2、总核糖核酸(RNA)的抽提试剂盒
[0023] 抽提总核糖核酸(RNA)采用TRIZOL (Invitrogen),该试剂是基于酸性酚一步抽提 法生产的。TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时 能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。 收集上面的的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。用于抽提总核糖核酸(RNA)所用 的器皿和水均进行核糖核酸酶灭活处理,以保证实验中无核糖核酸酶的环境。
[0024] 3、核糖核酸(RNA)抽提步骤
[0025] RNA提取的一般步骤是:破碎组织一分离RNA -沉淀RNA -洗涤RNA -融解RNA - 保存RNA。破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行,可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白 酶K等破碎组织,加入β-ΜΕ可以抑制RNA酶活性。分离RNA -半用酚、氯仿等有机溶剂, 加入少量异戊醇,经过此步,离心,RNA-般分布于上层,与蛋白层分开。沉淀RNA -般用乙 醇、3Μ NaAc (pH-5. 2)或异丙醇。洗涤RNA使用70%乙醇洗涤,有时,为避免RNA被洗掉, 此步可以省掉,洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇,但是不能过于干燥,否则不易溶解。融解 RNA -般使用TE。保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染,从富含RNase的 样品(如胰脏、肝脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于长期贮存 更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA,在水中贮存一个星期就基本降解了,而从大鼠脾脏中 提取的RNA,在水中保存3年仍保持稳定。另外,长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的 降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性,可以将RNA溶解在去离子的甲 酰胺中,存于_70°C。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的 RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时,可以使用下列方法沉淀RNA :加入 NaAc 至 0· 3M,12, 000X g 离心 5 分钟。
[0026] 4、cDNA 的合成
[0027] (1)冰浴离心管里面加入模板RNA4 μ L(1 μ g/ μ L),随机引物2 μ L(20pmol/ μ L), 去离子水5 μ L,混匀,离心3-5秒;
[0028] (2) 70°C水浴5分钟,冰浴30秒(此处是为了使引物和模板正确配对);
[0029] (3)加入5XM-MLV逆转录酶第一链缓冲液4 μ L(200U/ μ I),RNase抑制剂 1 μ L (Ribonuclease Inhibitor,40U/ μ I,TaKaRa),dNTP2 μ L (2. 5mM,TaKaRa)(这些应该先 配好,然后分再装到每一管),混匀;
[0030] (4) 37°C水浴5分钟,加入1 μ L M-MLV RT反转录酶(200U/ μ 1),混匀;
[0031] (5) 37°C水浴1小时(此步是反转录过程);
[0032] (6) 70°C、10分钟结束反应(此处是灭活酶活性,避免对后续实验产生干扰),产物 置冰上进行下一步PCR实验,余下的-70°C保存。
[0033] 5、RT-PCR的引物设计及扩增
[0034] 理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物 可能会同扩增其他的非目的序列。设计理想的引物都有以下共同的特点:典型的引物18到 24个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能 性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配 对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。选择GC含量为40%到 60%或GC含量反映模板GC含量的引物。设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加 引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。避免引物对3'末端存在互补序列,这会形 成引物二聚体,抑制扩增。避免3'末端富含
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