一种诺如病毒的检测试剂盒及其应用

文档序号:8407763阅读:1167来源:国知局
一种诺如病毒的检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微生物的检测方法,特别是涉及一种用于检测诺如病毒的试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 诺如病毒,又称诺瓦克病毒(Norwalk Viruses,NV)是人类杯状病毒科(Human Calicivirus,HuCV)中诺如病毒(Norovirus,NV)属的原型代表株。它是一组形态相似、抗 原性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒(Norovirus)是导致急性胃肠炎最主要的病原之一。
[0003] 诺如病毒有许多共同特征:直径约为26~35nm,无包膜,表面粗糙,球形,呈二十 面体对称;从急性胃肠炎病人的粪便中分离,不能在细胞或组织中培养,也没有合适的动物 模型;基因组为单股正链RNA ;诺如病毒感染性强,以肠道传播为主,可通过污染的水源、食 物、物品、空气等传播,常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴 发。
[0004] 目前主要是通过免疫学的方法对诺如病毒进行检测,但由于免疫学的方法灵敏度 低,不能在发病早期就检测出诺如病毒,这样就会导致误诊,并增加了病人的负担;因此研 发一种灵敏度高,方法简单,耗时短,能直接快速检测粪便中诺如病毒的试剂盒会有很好的 应用价值。

【发明内容】

[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种特异性好,灵敏度高,使用简便,能直接快速 检测粪便中诺如病毒的试剂盒及其应用。根据诺如病毒的序列保守区域RNA依赖的RNA聚 合酶区,使用Primer5. 0软件设计了特异性引物,通过使用实时荧光定量PCR的方法,对诺 如病毒的感染进行辅助诊断,以及诺如病毒的流行病学研宄。
[0006] 本发明一种诺如病毒的检测试剂盒,其包括一对引物和TaqMan探针;其中,所述 的一对引物为引物1和引物2 ;所述引物1的核苷酸序列如序列表中的序列1所示;所述引 物2的核苷酸序列如序列表中的序列2所示;所述TaqMan探针的核苷酸序列如序列表中序 列3所示。
[0007] 进一步,本发明一种诺如病毒的检测试剂盒,所述TaqMan探针的5'端标记有荧光 报告基团FAM,3'端标记有荧光淬灭基团BHQl。
[0008] 进一步,本发明一种诺如病毒的检测试剂盒,所述引物1、引物2和TaqMan探针的 摩尔比为4:4:1。
[0009] 进一步,本发明一种诺如病毒的检测试剂盒,其还包括反应缓冲液,逆转录酶,DNA 聚合酶,DEPC水。
[0010] 进一步,本发明一种诺如病毒的检测试剂盒,其包括浓度为40μΜ的引物 10. 5 μ L,浓度为40 μ M的引物20. 5 μ L,浓度为10 μ M的TaqMan探针0. 5 μ L,2 X反应缓冲 液12. 5 μ L,40 X逆转录酶和DNA聚合酶混合液0. 625 μ L,DEPC水5. 375 μ L。
[0011] 本发明一种诺如病毒的检测试剂盒的应用,其用于检测诺如病毒。
[0012] 进一步,本发明一种诺如病毒的检测试剂盒的应用,其包括以下步骤:
[0013] -、提取样品RNA ;
[0014] 二、将样品RNA与权利要求1所述诺如病毒的检测试剂盒中的试剂混合;
[0015] 三、按照以下条件进行反应:第一阶段48°C 30min,第二阶段95°C lOmin,第三阶段 95°C 15s,60°C lmin,扩增45个循环;并在第三阶段进行荧光信号采集。
[0016] 进一步,本发明一种诺如病毒的检测试剂盒的应用,所述步骤一中提取样品RNA 的步骤为:取粪便标本〇. 5g,用磷酸盐缓冲液1:10稀释后,涡旋混匀,并4000rpm离心 15min,收集上清液至无菌管中,用Trizol (Invitrogen公司产品)提取标本中的RNA ;所提 取的RNA溶于20 μ L DEPC水中。
[0017] 进一步,本发明一种诺如病毒的检测试剂盒的应用,所述步骤二中样品与试剂的 量为:样品RNA 5 μ L,40 μ M的引物10. 5 μ L,浓度为40 μ M的引物20. 5 μ L,浓度为10 μ M 的TaqMan探针0.5 μ L,2X反应缓冲液12. 5 μ L,40X逆转录酶和DNA聚合酶混合液 0· 625 μ L,DEPC 水 5. 375 μ L。
[0018] 本发明一种诺如病毒的检测试剂盒及其应用与现有技术不同之处在于:本发明的 诺如病毒的检测试剂盒特异性好,灵敏度高,使用简单方便,耗时短,不仅能够用于临床急 性腹泻患者对诺如病毒感染的检测,也可用于诺如病毒感染流行病学的调查;在疫情暴发 时能够提供快速特异的病原学依据。
[0019] 下面结合附图对本发明的一种诺如病毒的检测试剂盒及其应用作进一步说明。
【附图说明】
[0020] 图1为采用本发明的诺如病毒的检测试剂盒对不同浓度的诺如病毒阳性质粒进 行检测的实时荧光定量PCR结果;
[0021] 图2为采用本发明的诺如病毒的检测试剂盒对样品进行检测的实时荧光定量PCR 结果。
【具体实施方式】
[0022] 获取本发明中引物和TaqMan探针的方法:使用Mega 5. 0软件对在GenBank中现 有诺如病毒的基因序列进行序列的生物信息学分析,通过同源性比较,寻找保守区域;应用 ABI 引物合成软件(Primer Express version 2. 0,Applied Biosystems)设计了扩增保守 区基因片段的引物及TaqMan探针;所设计的引物和探针均具有互补于诺如病毒基因的序 列,应用 NCBI/Primer-BLAST (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)对所设计合成的引 物及TaqMan探针进行特异性及可用性检测,确保与其它病原体的核酸序列没有同源性,也 不包括任何常见的核酸内切酶的酶切位点;所以避免了诺如病毒检测的假阳性和假阴性的 结果,提高了检测的可靠性和准确度。然后由Invitrogen公司合成,经PAGE纯化。
[0023] 实施例1
[0024] 为检测本发明中引物和TaqMan探针的敏感性,本实施例采用本发明的诺如病毒 的检测试剂盒对诺如病毒阳性标本RNA进行检测,步骤如下:
[0025] -、以诺如病毒阳性的标本RNA为模板,应用所设计合成的引物(即本发明中 的引物)扩增得到目的基因片段,纯化后将其克隆至PGEM-T载体(Invitrogen)。通过 蓝白斑筛选、PCR鉴定等得到含有目的基因片段的阳性质粒DNA。通过丘比特双链DNA 检测试剂盒(Quanti-iTTM dsDNA BR Assay kit)及丘比特焚光检测仪(the QubitTM fluorometer,2-100ng) (Invitrogen,Lot:55318A)对阳性质粒 DNA 进行定量。所得阳性质 粒DNA的浓度为9. 6X IO8拷贝数/微升,对其进行对数稀释,得到浓度分别为每微升10 °、 IO1UO2UO^ IO4拷贝数的样品,分别标记为1、2、3、4、5。
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