通过e3泛素连接酶增强靶蛋白质及其他多肽降解的化合物和方法
【专利说明】通过E3泛素连接酶增强靶蛋白质及其他多肽降解的化合 物和方法 发明领域
[0001] 本发明涉及双功能化合物，其被发现作为靶向泛素化的调节剂的应用性，特别是 作为多种被根据本发明所述的双功能化合物降解和/或以其他方式抑制的多肽及其他蛋 白质的抑制剂。具体地，本发明涉及这样的化合物：其一端包含结合VHLE3泛素连接酶的 VHL配体（定义为泛素配体结合部分或ULM I基团)并且另一端包含结合靶蛋白质的部 分（定义为蛋白质/多肽革巴向部分或|ptm|基团)，使得靶蛋白质/多肽被置于邻近泛素 连接酶，以引起该蛋白质降解（和抑制）。本发明呈现与根据本发明所述的化合物有关的与 靶向多肽降解/抑制一致的宽范围药理活性。
[0002] 相关申请和准许支持
[0003] 本申请要求2011年1月12日提交的相同标题的临时申请US61/585, 769的优先 权利益，其全部内容被引入本文作为参考。
[0004] 本发明是以国家卫生研究院（the National Institutes of Health)的准许号 AI084140在政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。
[0005] 发明背景
[0006] E3泛素连接酶（其中超过600种被人类所知）1为泛素化给予底物特异性，并且由 于其对某些蛋白质底物的特异性，是比一般蛋白酶体抑制剂 3,4更具吸引力的治疗靶。虽然 E3连接酶的配体的发展已被证实困难--部分是由于其一定会中断蛋白质-蛋白质相互 作用5的事实，但进来的发展已经提供结合（bind)这些连接酶的特异性配体。蛋白质-蛋 白质相互作用众所周知由于其大接触表面和所含浅沟或平界面是难以用小分子靶向的。相 反，大多数小分子药物结合在严密而明确的袋中的酶或受体 6。自发现nutlins--第一种 小分子E3连接酶抑制剂7--以来，已报告靶向凋亡蛋白质（IAPs) 8'9、SCFMet3(ll°、和SCFede411 的抑制剂的其他化合物；但是，该领域仍处于发展中。
[0007] -种具有令人振奋的治疗潜力的E3连接酶是冯希佩尔-林道（VHL)肿瘤抑制 剂--E3连接酶复合物VCB的底物识别亚单位，其也由延伸蛋白B和C、Cul2和Rbxl组成 12。VHL的主要底物是低氧诱导因子I a (HIF-1 α )，响应低氧水平上调基因如促血管生长因 子VEGF和红细胞诱导细胞因子的促红细胞生成素的转录因子。虽然HIF-I α被组成型表 达，但其胞内水平在常氧条件下保持很低--通过脯氨酰羟化酶结构域（PHD)蛋白使其羟 基化和随后的VHL介导的泛素化（图1)。
[0008] 采用合理的设计，我们已生成冯希佩尔-林道（VHL)的第一种小分子配体--E3 连接酶VCB的底物识别亚单位，在癌症、慢性贫血和缺血中重要的靶标 2。我们还已获得具 有我们的最有效配体15的VHL的晶体结构，确定该化合物模拟转录因子HIF-I a--VHL 的主要底物--的结合模式。
[0009] 从较早的结合VHL的羟基化HIF肽的生物化学和结构研究中，已经清楚羟脯氨酸 在介导这种蛋白质：蛋白质相互作用中发挥重要作用。基于该项工作，发明人研发了羟基化 HIF肽：VHL荧光极化（FP)结合分析，借此他们分析了 >120种具有侧接非肽部分的中心羟 脯氨酸残基的化合物。深化该研究，发明人现已研究出与七种顶端化合物复合的VHL的共 晶体结构。对这些配体结合结构的分析驱使下一代VHL配体的设计/合成，下一代VHL配 体与蛋白质结合部分连接以产生根据本发明所述的双功能化合物。
[0010] 本发明的主要理论依据是我们的普罗太克（PROTAC)(蛋白水解靶向嵌合体）技 术需要小分子E3连接酶配体。该技术将靶向的蛋白质/多肽引至E3连接酶，以进行泛素 化和随后的蛋白酶体降解。在几个思路证明实验中，本发明人证明了利用来自结合VHL的 HIF的短肽序列的这种方法的应用性。为制成更'像药物'的普罗太克，本发明人已用'小 分子' VHL配体替代HIF肽，从而提供将蛋白质募集至E3连接酶以进行泛素化和降解的方 式，从而最终提供基于这种蛋白质降解的疗法。
[0011] 发明目的
[0012] 本发明的一个目的是提供具有将内源蛋白质募集至E3泛素连接酶以进行降解的 功能的化合物。
[0013] 本发明的另一目的是提供调节患者或对象内蛋白质降解并且可用于治疗通过降 解蛋白质调节的疾病状态或状况的化合物。
[0014] 本发明的另一目的是提供基于上述调节剂--特别是包括用于患者或对象的治 疗处理的抑制剂-的药物组合物，该患者或对象优选包括人患者或对象。
[0015] 本发明的又一目的是提供确定结合目标蛋白质的蛋白质结合部分的方法。
[0016] 本发明的再一目的是提供鉴定生物学系统--特别是包括人系统--中结合根 据本发明所述的化合物的蛋白质结合部分的内源蛋白质的方法。
[0017] 本发明的再一目的是提供利用根据本发明所述的化合物鉴定降解生物学系统中 的目标蛋白质的效果的方法。
[0018] 本发明的再一方面是提供治疗患者的方法，其中靶向的蛋白质降解将产生目的治 疗效果。
[0019] 本发明的另一目的是提供可用于第一医疗应用的化合物和组合物。
[0020] 本发明的再一方面是提供用于治疗患者的化合物和/或组合物，其中靶向的蛋白 质降解将产生目的治疗效果。
[0021] 本发明的这些和/或其他目目的中的任意一个或多个可通过对本发明下文描述 的常规阅读而显而易见。
[0022] 附图简述
[0023] 图1显示（A)HIF-I α积累导致低氧响应涉及的基因如促红细胞生成素和VEGF的 转录上调。（B)在常氧条件下，HIF-Ia被羟基化，被VHL识别，被泛素化和被蛋白酶体降 解，从而防止转录上调。
[0024] 图 2. WaterLOGSY NMR 光谱显示 3 而非 L-Hyp 或 NAc-Hyp-NMe 与 VHL 结合。
[0025] 图3显示图形表示显示15和VHL之间的关键相互作用。
[0026] 图4显示结合VHL的15(最轻灰色碳）的2.9 A共晶体结构，表示其结合模拟 HIF-Ia肽（轻灰色碳，pdb 1LM817)的结合。
[0027] 图5显示V54BC apo (A)的晶体结构和在与15的复合物⑶中的晶体结构。Hyp结 合位点残基（条状，黄色碳）和保守水分子（红色点）以及15(条状，青色碳）周围叠加的 电子密度（2&-F。）显示为蓝色，并且在1.2 〇呈波状。蛋白质表面显示50%透明度，为绿 色。
[0028] 图6-12Α和B显示在描述的VHL极化/移位分析中根据本发明所述的各个化合物 的活性。根据本发明所述的化合物在各图顶部用编号标示。对照化合物显示在图15Β中， 并且充当最小极化（最大移位），以进行比较。显示的抑制百分比通过相对于最大和最小极 化标准化而确定，和相对于log[VL]作图。每次重复（η = 9)的IC5tl值利用Prism 5确定， 然后平均化以确定平均IC5tl和平均值误差标准（SEM)。
[0029] 图13 (连同表2-亲和力表）显示根据本发明所述的多种示例性化合物。
[0030] 图14显示根据本发明所述的、来自表2的多种优选化合物。
[0031] 图15显示更多根据本发明所述的化合物和其活性。多数化合物在100μΜ浓度以 下具有活性。
[0032] 图16显示根据本发明所述的、来自图15的多种优选的化合物。
[0033] 图17显示根据本发明所述的来自图15的八种特别优选的化合物。
[0034] 图18显示根据本发明所述的六种优选的化合物，其包含连接至优选的泛素配体 结合部分的雌激素结合蛋白靶向部分。
[0035] 图19显示根据本发明所述的优选化合物种类。
[0036] 发明概述
[0037] 本发明基于如下发现：一旦泛素途径蛋白质和靶蛋白质通过结合泛素途径蛋白质 和靶蛋白质的嵌合构建体被邻近安置，泛素途径蛋白质就使任何靶蛋白质泛素化。因此，本 发明提供导致选定靶蛋白质泛素化的组合物。本发明还提供组合物库及其应用。
[0038] 在一个实施方式中，本发明提供可用于调节蛋白质活性的组合物。组合物包括根 据限定化学结构的泛素途径蛋白质结合部分（优选用于Ε3泛素连接酶，单独或与Ε2泛素 结合酶的复合物，该Ε2泛素结合酶负责将泛素转移至靶向的蛋白质）和蛋白质靶向部分， 其优选通过连接体连接在一起，其中泛素途径蛋白质结合部分识别泛素途径蛋白质，并且 靶向部分识别靶蛋白质，并且其中泛素途径蛋白质结合部分偶联于靶向部分。
[0039] 在另一实施方式中，本发明提供化合物库。该库包括一种以上化合物，其中每种组 合物均具有式Α-Β，其中A是泛素途径蛋白质结合部分（优选地，Ε3泛素连接酶部分，如本 文另外公开），并且B是分子库的蛋白质结合部件，其中A偶联（优选地，通过连接体部分） 于Β，并且其中泛素途径蛋白质结合部分识别泛素途径蛋白质，具体地，Ε3泛素连接酶。在
【具体实施方式】中，该库包含Ε3泛素连接酶的VHL的特异性泛素化识别肽（泛素途径蛋白质 结合部分，如本文另外公开）和随机靶蛋白质结合元件（例如，化学化合物库）。因此，靶蛋 白质未被提前确定，并且该方法可用于确定在通过泛素连接酶降解后假定蛋白质结合元件 的活性及其作为靶的药理值。
[0040] 在又一实施方式中，本发明提供筛选本发明的库以识别包含靶向部分的化合物的 方法，该靶向部分识别与细胞预定功能相关的靶蛋白质。方法包括用库实体群（pool of entities)培育细胞；监测细胞预定功能；鉴定改变细胞预定功能的实体群；用来自被鉴定 的实体群的组合物培育细胞；监测细胞预定功能；和鉴定改变细胞预定功能的组合物，其 中被鉴定的组合物包含识别与预定功能相关的靶蛋白质的靶向部分。
[0041] 在另一实施方式中，本发明提供筛选本发明的库以识别包含靶向部分的组合物的 方法，该靶向部分识别与细胞预定功能相关的靶蛋白质。方法包括用来自库的各组合物培 育细胞；监测细胞预定功能；鉴定改变细胞预定功能的组合物；其中被鉴定的组合物包含 识别与预定功能相关的靶蛋白质的靶向部分。
[0042] 在又一实施方式中，本发明提供鉴定与细胞预定功能相关的靶蛋白质的方法。方 法包括用来自本发明的库的组合物培育细胞；监测细胞预定功能；鉴定改变细胞预定功能 的组合物；鉴定结合被鉴定的组合物的靶蛋白质，其中靶蛋白质与细胞预定功能相关。 [0043] 在又一实施方式中，本发明提供鉴定与细胞预定功能相关的靶蛋白质的方法。方 法包括用来自本发明的库的实体群培育细胞；监测细胞预定功能；鉴定改变细胞预定功能 的实体群；用来自被鉴定的实体群的组合物培育细胞；监测细胞预定功能；鉴定改变细胞 预定功能的组合物；和鉴定结合被鉴定的组合物的靶蛋白质，其中靶蛋白质与细胞预定功 能相关。
[0044] 在又一实施方式中，本发明提供泛素化/降解细胞中的靶蛋白质的方法。方法包 括给予双功能组合物，该双功能组合物包括泛素途径蛋白质结合部分和靶向部分，其优选 通过连接体部分连接，如本文另外描述，其中泛素途径蛋白质结合部分偶联于靶向部分，并 且其中泛素途径蛋白质结合部分识别泛素途径蛋白质（例如，泛素连接酶，优选E3泛素连 接酶），并且靶向部分识别靶蛋白质，使得当靶蛋白质被置于邻近泛素连接酶时发生靶蛋白 质降解，由此导致降解/抑制靶蛋白质的作用和控制蛋白质水平。本发明给予的蛋白质水 平控制提供疾病状态或状况的治疗--经由靶蛋白质、通过降低患者细胞中该蛋白质的水 平来调节。
[0045] 在另一实施方式中，本发明涉及治疗需要通过蛋白质来调节疾病状态或状况的患 者的方法，其中该蛋白质的降解会在该患者中产生治疗效果，方法包括给予有需要的患者 有效量的根据本发明所述的化合物，任选地组合另一生物活性剂。疾病状态或状况可以是 微生物剂或其他外源剂如病毒、细菌、真菌、原生动物或其他微生物引起的疾病，或可以是 导致疾病状态和/或状况的蛋白质过表达所引起的疾病状态。
[0046] 在一个实施方式中，本发明涉及根据下列结构的化合物：
【主权项】
1. 根据下列化学结构的化合物： 其中L是连接体基团，并且
是泛素连接酶结合部分，其中所述连接体基团任选地进一步连接于i 团。
2. 根据下列化学结构的化合物：
其4
是泛素连接酶结合部分；
是化学部分（蛋白质靶部分），其结合将要通过泛素连接酶降解的靶蛋白质或 多肽，并且直接或通过连接体部分L化学连接于
基团，其也是泛素连接酶结合部分，其可与
基团相同或不同并且直接或通过连接 体部分连接吁
基团；和 L是连接体部分，其可存在或不存在，并且在存在时，化学地（共价地）连接
与
或 1-1， 其药学上可接受的盐、对映体、立体异构体、溶剂化物或多晶型物。
3. 根据权利要求2所述的化合物，其爿
：团。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中
是根据下列化学结构的基 团：
其中R1'是任选取代的C1-C6烷基、任选取代的-(CH2) n0H、任选取代的-(CH2) nSH、任选 取代的（CH2)n-O-(C1-C6)烷基、包含环氧化物部分的任选取代的（CH 2)n-WCHOCHW-(Cci-C6)烷 基，其中W独立地不存在或是H、任选取代的-(CH 2) nC00H、任选取代的-(CH2) nC (0) - (C1-C6 烷基）、任选取代的-(CH2) JR1R2、任选取代的-(CH2) nNHC (0) -R1、任选取代的-(CH2) nC (0) -NR1R2、任选取代的-(CH2)n0C (0) -NR1R2、- (CH2O)nH、任选取代的-(CH2)n0C (0) - (C1-C6 烷基）、任选取代的-(CH2) nC (0) -0- (C1-C6烷基）、任选取代的-(CH 20) nC00H、任选取代 的-(OCH2)n0- (C1-C6烷基）、任选取代的-(CH 20)nC (0) - (C1-C6烷基）、任选取代的-(0CH 2) nNHC (0) -R1、任选取代的-(CH2O) nC (0) -NR1R2、- (CH2CH2O) nH、任选取代的-(CH2CH2O) nC00H、任 选取代的-(OCH2CH2) n0- (C1-C6烷基）、任选取代的-(CH 2CH20) nC (0) - (C1-C6烷基）、任选取代 的-(OCH2CH2) JHC(O)-R1、任选取代的-(CH2CH2O) W(O)-NR1R2、任选取代的-SO2Rs、任选取代 的S(0)R s、N02、CN或卤素（F、Cl、Br，I，优选F或Cl); 札和R 2各自独立地是H或C「C6烷基，其可任选地用一个或两个羟基或上至三个卤素 基团（优选氟）取代； 馬是C ^C6烷基、任选取代的芳基、杂芳基或杂环基团或-(CH JmNR1R2基团， 父和父'各自独立地是(：_0、(：_5、-5(0)、5(0)2，（优选父和父'均为(：_0); R2'是任选取代的-(CH2)n-(C = O)u(NR1)v(SO2)w(C 1-C6)烷基、任选取代的 RinR2n- (CH2) n-(C = 0) u (NR1) v (SO2)wNRinR2n基团、任选取代的-(CH 2) n-(C = 0) u (NR1) V(SO2)w-芳基、 任选取代的-(CH2) n- (C = 0) u (NR1) v (SO2) w-杂芳基、 任选取代的-(CH2) n- (C = 0) JR1 (SO2) w-杂环、 任选取代的-NR1- (CH2) n-C (0) u (NR1) v (SO2) W-C「C6烷基、 任选取代的-NR1- (CH2) n-C (0) u (NR1) v (SO2) W-NR1NR2N、 任选取代的-NR1- (CH2) n-C (0) u (NR1) v (SO2) W-NR1C (0) R1n、 任选取代的-NR1-(CH2) n-(C = C^u(NR1) v (SO2)w-芳基、 任选取代的-NR1-(CH2) n-(C = 0) u (NR1)v (SO2)w-杂芳基或 任选取代的-NR1-(CH2) n-(C = OhNR1 (SO2)w-杂环、 任选取代的-Kr2 -C1-C6烷基； 任选取代的-χΚ2' -芳基； 任选取代的-χΚ2' -杂芳基； 任选取代的-χΚ2'-杂环基团； R3'是任选取代的C1-C6烷基、 任选取代的-(CH2) n-C (0) u (NR1) v (SO2) W-C「C6烷基、 任选取代的-(CH2) n-C (0) u (NR1) v (SO2) W-NR1NR2N、 任选取代的-(CH2)n-C(O)u(NR1) v(SO2)w-NR1C(O)IV 任选取代的-(CH2)n-C(O)u(NR1) v(SO2)w-C(O)NR1Rp 任选取代的-(CH2) n-C (0) u (NR1) v (SO2) w-芳基、 任选取代的-(CH2) n-C (0) u (NR1) v (SO2) w-杂芳基、 任选取代的-(CH2) n-C (0) u (NR1) v (SO2) w-杂环、 任选取代的-NR1- (CH2) n-C (0) u (NR1) v (SO2) W-C「C6烷基、 任选取代的-NR1- (CH2)