生产l-氨基酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种使用细菌生产L-氨基酸的方法。L-氨基酸在工业上用作动物饲 料的添加剂、调味料、食品和饮料、氣基酸灌输的成分，等等。
【背景技术】
[0002] 在工业上通过例如使用具有L-氨基酸生产能力的各种微生物的发酵来生产L-氨 基酸。通过发酵生产L-氨基酸的方法的实例包括，例如，使用野生型微生物（野生型菌株） 的方法，使用源自野生型菌株的营养缺陷型菌株的方法，使用源自野生型菌株的作为对各 种药物中的任一种的抗性突变菌株的代谢调控突变菌株的方法和使用同时具有营养缺陷 型菌株和代谢调控突变菌株特征的菌株的方法。
[0003] 此外，在近些年来，将L-氨基酸生产能力通过重组DNA技术提高的微生物用于 L-氨基酸生产。用于提高微生物的L-氨基酸生产能力的方法的实例包括，例如，增强编码 L-氨基酸生物合成酶的基因的表达（专利文献1和2)和提高碳源流入L-氨基酸生物合成 系统中（专利文献3)。
[0004] acpP基因是编码酰基载体蛋白（ACP)的基因（非专利文献1)。ACP翻译为无活性 的apo-ACP，然后4'-磷酸泛酰巯基乙胺作为辅因子通过ACP合成酶添加至apo-ACP的位置 36的丝氨酸残基（在大肠埃希氏菌（Escherichia coli)的情况中），并且由此将apo-ACP 制成活性的holo-ACP。ACP是在细菌的脂肪酸生物合成等中起着重要作用的蛋白质。特别 地，在脂肪酸生物合成中，ACP (holo-ACP)通过4' -磷酸泛酰疏基乙胺基团结合脂肪酸链， 由此携带脂肪酸链。
[0005] fabF基因是编码β -酮酰基-ACP合成酶II的基因（非专利文献1)。β -酮酰 基-ACP合成酶II是脂肪酸生物合成酶之一，并且参与脂肪酸链的延伸。特别地，β -酮酰 基-ACP合成酶II催化从酰基ACP (碳数=η)和丙二酰-ACP产生3-氧酰基-ACP (碳数= η+2)的反应（EC 2. 3. L 41)。
[0006] 在大肠埃希氏菌中，参与脂肪酸生物合成的基因，包括acpP基因和fabF基因， 作为yceD-rpmF-plsX-fabHDG-acpP-fabF基因簇存在。这一基因簇的基因共同转录为 几个基因对（非专利文献1)。例如，acpP基因和fabF基因共同转录为acpP-fabF操 纵子。此外，fabF基因还使用其自身的启动子独立地转录。此外，acpP基因还可以从 yceD-rpmF-plsX-fabHDG-acpP-fabF基因族中的fabD基因和fabG基因共同转录。
[0007] 然而，acpP和fabF基因与L-氨基酸生产之间的关联还是未知的。
[0008] 现有技术参考文献
[0009] 专利文献
[0010] 专利文献1 :美国专利No. 5, 168, 056
[0011] 专利文献2 :美国专利No. 5, 776, 736
[0012] 专利文献3 :美国专利No. 5, 906, 925
[0013] 非专利文献
[0014] 非专利文献1:21^叩￥，0〇仙11邛介.，18&(^61^〇1.，1996 年6月；178(12): 3614-20
[0015] 发明概述
[0016] 本发明待实现的目的
[0017] 本发明的目的是研发用于提高细菌的L-氨基酸生产能力的新技术，并且由此提 供用于有效生产L-氨基酸的方法。
[0018] 实现目的的方法
[0019] 本发明的发明人进行了各种研宄，以实现上述目的。结果，发明人发现了可以通过 修饰细菌，使得降低acpP和fabF基因的表达，从而提高细菌的L-氨基酸生产能力，并完成 了本发明。
[0020] SP，例如，本发明可以具体化，如下。
[0021] [1]
[0022] -种生产L-氨基酸的方法，包括：
[0023] 在培养基中培养属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae)并具有L-氨基酸生产能力 的细菌，以在细菌的培养基或细胞中产生并累积L-氨基酸；和
[0024] 从培养基或细胞收集L-氨基酸；
[0025] 其中细菌已经进行了修饰，使得acpP-fabF操纵子减弱。
[0026] [2]
[0027] 如上所述的方法，其中所述acpP-fabF操纵子的减弱是指由acpP-fabF操纵子的 基因编码的蛋白质的活性降低。
[0028] [3]
[0029] 如上所述的方法，其中通过减弱acpP-fabF操纵子的基因的表达来减弱 acpP-fabF 操纵子。
[0030] [4]
[0031] 如上所述的方法，其中通过修饰基因的表达控制序列来减弱acpP-fabF操纵子的 基因的表达。
[0032] [5]
[0033] 如上所述的方法，其中acpP-fabF操纵子的基因由acpP基因和/或fabF基因组 成。
[0034] [6]
[0035] 如上所述的方法，其中acpP-fabF操纵子的基因由acpP基因和fabF基因组成。
[0036] [7]
[0037] 如上所述的方法，其中通过用另一个碱基替代acpP基因的比翻译起始位点靠上 游的位置-34的胞嘧啶来减弱acpP-fabF操纵子的基因的表达。
[0038] [8]
[0039] 如上所述的方法，其中通过用腺嘌呤替代acpP基因的比翻译起始位点靠上游的 位置-34的胞嘧啶来减弱acpP-fabF操纵子的基因的表达。
[0040] [9]
[0041] 如上所述的方法，其中细菌是属于埃希氏菌属（Escherichia)、泛菌属（Pantoea) 或肠杆菌属（Enterobacter)的细菌。
[0042] [10]
[0043] 如上所述的方法，其中细菌是大肠埃希氏菌。
[0044] [11]
[0045] 如上所述的方法，其中L-氨基酸是L-赖氨酸。
[0046] [12]
[0047] -种生产L-赖氨酸的方法，包括：
[0048] 在培养基中培养具有L-赖氨酸生产能力的大肠埃希氏菌，以在大肠埃希氏菌的 培养基或细胞中产生并累积L-赖氨酸；和
[0049] 从培养基或细胞收集L-赖氨酸；
[0050] 其中已经通过修饰基因的表达控制序列，减弱了大肠埃希氏菌中的acpP-fabF操 纵子的基因的表达。
[0051] [13]
[0052] -种生产L-赖氨酸的方法，包括：
[0053] 在培养基中培养具有L-赖氨酸生产能力的大肠埃希氏菌，以在大肠埃希氏菌的 培养基或细胞中产生并累积L-赖氨酸；和
[0054] 从培养基或细胞收集L-赖氨酸；
[0055] 其中该大肠埃希氏菌中的acpP基因的比翻译起始位点靠上游的位置-34的胞嘧 啶已用其他碱基替代。
[0056] [14]
[0057] -种生产L-赖氨酸的方法，包括：
[0058] 在培养基中培养具有L-赖氨酸生产能力的大肠埃希氏菌，以在大肠埃希氏菌的 培养基或细胞中产生并累积L-赖氨酸；和
[0059] 从培养基或细胞收集L-赖氨酸；
[0060] 其中该大肠埃希氏菌中的acpP基因的比翻译起始位点靠上游的位置-34的胞嘧 啶已用腺嘌呤替代。
[0061] 发明实施方式
[0062] 下文，将详细解释本发明。
[0063] 本发明的方法是一种生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养属于肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)并具有L-氨基酸生产能力的细菌，以在细菌的培养基或细胞中产 生并累积L-氨基酸，并从培养基或细胞收集L-氨基酸，其中细菌已经进行了修饰，使得 acpP-fabF操纵子减弱。用于这种方法中的细菌也称为"本发明的细菌"。
[0064] 〈1>本发明的细菌
[0065] 本发明的细菌是属于肠杆菌科并具有L-氨基酸生产能力的细菌，其已经进行了 修饰，使得acpP-fabF操纵子减弱。
[0066] 〈1-1>具有L-氨基酸生产能力的细菌
[0067] 在本发明中，"具有L-氨基酸生产能力的细菌"是指在培养基中培养细菌时，具有 以可以收集L-氨基酸的程度在细菌的培养基或细胞中产生并累积目标L-氨基酸的能力的 细菌。具有L-氨基酸生产能力的细菌可以是以大于未修饰菌株可获得的含量在培养基中 累积目标L-氨基酸的细菌。未修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。具有L-氨基 酸生产能力的细菌可以是以优选〇. 5g/L或更高，更优选1.0 g/L或更高的含量在培养基中 累积目标L-氨基酸的细菌。
[0068] L-氨基酸的实例包括碱性氨基酸，如L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸 和L-瓜氨酸；脂肪族氨基酸，如L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和甘氨酸； 其是羟基-单氨基羧酸的氨基酸，如L-苏氨酸和L-丝氨酸；环状氨基酸，如L-脯氨酸；芳 香族氨基酸，如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸；含硫氨基酸，如L-半胱氨酸、L-胱氨 酸和L-甲硫氨酸；酸性氨基酸，如L-谷氨酸和L-天冬氨酸；以及在侧链中具有酰胺基团的 氨基酸，如L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺。本发明的细菌可以具有生产单种L-氨基酸，或两 种或多种L-氨基酸的能力。
[0069] 在本发明中，术语"氨基酸"可以是指L-氨基酸，除非另外指出。此外，待生产的 L-氨基酸可以是游离化合物，其盐，或其混合物。即，在本发明中，术语"L-氨基酸"可以是 指游离形式的L-氨基酸，其盐，或其混合物，除非另外指出。之后将描述盐的实例。
[0070] 术语肠杆菌科的细菌的实例包括属于埃希氏菌属（Escherichia)、肠杆菌 属（Enterobacter)、泛菌属（Pantoea)、克雷伯氏菌属（Klebsiella)、沙雷氏菌属 (Serratia)、欧文氏菌属（Erwinia)、Photorhabdus、普罗威登斯菌属（Providencia)、沙 门氏菌属（Salmonella)、摩根氏菌属（Morganella)等的细菌。特别地，可以使用根据 NCBI (国际生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information))数据 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Taxonomy/Browser/wwwtax. cgi ? id = 91347)中使 用的分类系统归入肠杆菌科的细菌。
[0071] 埃希氏菌属细菌没有特别限制，并且其实例包括根据微生物学领域中的技术人员 已知的分类系统归入埃希氏菌属的那些。埃希氏菌属细菌的实例包括，例如，Neidhardt 等的工作中描述的那些（Backmann B.J.，1996，Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12 (大肠埃希氏菌 K-12 的一些突变衍生株 的衍生和基因型），ρρ· 2460-2488,表 1，见 F. D. Neidhardt (编辑），Escherichia coIi and Salmonella Cellular and Molecular Biology(大肠埃希氏菌和沙门氏菌细胞和分子生 物学），第 2 版，American Society for Microbiology Press，Washington，D.C·)。埃希氏 菌属细菌的实例包括，例如，大肠埃希氏菌。大肠埃希氏菌的特定实例包括，例如，源自原型 野生型菌株K-12菌株的大肠埃希氏菌W3110(ATCC 27325)和大肠埃希氏菌MG1655(ATCC 47076)〇
[0072] 肠杆菌属细菌没有特别限制，并且其实例包括根据微生物学领域的技术人员已知 的分类归入肠杆菌属的那些。肠杆菌细菌的实例包括，例如，成团肠杆菌（Enterobacter agglomerans)和产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes)。成团肠杆菌的特定实例包括， 例如，成团肠杆菌ATCC 12287菌株。产气肠杆菌的特定实例包括，例如，产气肠杆菌ATCC 13048 菌株、NBRC 12010 菌株（Biotechnol Bioeng.，2007 年 3 月 27 日；98 (2) : 340-348) 和AJ110637菌株（FERM ABP-10955)。肠杆菌属细菌的实例还包括，例如，欧洲专利申请公 开（EP-A)No. 0952221中描述的菌株。此外，成团肠杆菌还包括一些归为成团泛菌（Pantoea agglomerans)的菌株。
[0073] 泛菌属细菌没有特别限制，并且其实例包括根据微生物学领域的技术人员已知的 分类归入泛菌属的那些。泛菌属细菌的实例包括，例如，菠萝泛菌（Pantoea ananatis)、斯 氏泛菌（Pantoea stewartii),成团泛菌（Pantoea agglomerans)和朽1 檬泛菌（Pantoea citrea)。菠萝泛菌的特定实例包括，例如，菠萝泛菌LMG20130菌株、AJ13355菌株（FERM BP-6614)、AJ13356 菌株（FERM BP-6615)、AJ13601 菌株（FERM BP-7207)、SC17 菌株（FERM BP-11091)和SC17(0)菌株（VKPM B-9246)。基于16S RNA的核苷酸序列分析等，成团肠杆 菌的一些菌株最近重新归入成团泛菌。（Int. J. Syst. Bacteriol.，43,162-173 (1993))。在 本发明中，泛菌属细菌包括如上所述的重新归入泛菌属的那些。
[0074] 埃文氏属细菌的实例包括解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora)和胡萝卜软 腐欧文氏菌（Erwinia carotovora)。克雷伯氏菌属细菌的实例包括植生克雷伯氏菌 (Klebsiella planticola)〇
[0075] 这些菌株例如可以从美国典型微生物保藏中心（American Type Culture Collection)获得（地址：12301Parklawn Drive，Rcokville，Maryland 20852，P.O.Box 1549，Manassas VA 20108，United States of America)。即，给各自的菌株给出了注册号， 并且可以通过使用这些注册号订购菌株（参见http://www. atcc. org)。菌株的注册号列在 美国典型微生物保藏中心的目录中。
[0076] 本发明的细菌可以是内在地具有L-氨基酸生产能力的细菌，或可以是修饰的使 得其具有L-氨基酸生产能力的细菌。可以通过将L-氨基酸生产能力给予如上所述的细菌， 或通过增强如上所述细菌的L-氨基酸生产能力，来获得具有L-氨基酸生产能力的细菌。
[0077] 为了给予或增强L-氨基酸生产能力，可以使用棒状杆菌细菌、埃希氏菌属细菌等 的氨基酸生产菌株育种中常用的方法（参见"Amino Acid Fermentation (氨基酸发酵）"， Gakkai Shuppan Center (Ltd.)，第 1 版，1986 年 5 月 30 日出版，PP. 77-100)。这样的方法 的实例包括，例如，获取营养缺陷型菌株、获取L-氨基酸类似物-抗性菌株、获取代谢调控 突变菌株和构建其中L-氨基酸生物合成酶活性增强的重组菌株。在L-氨基酸生产细菌的 育种中，可以单独给予上述特性之一，如营养缺陷型、类似物抗性和代谢调控突变，或可以 组合给予两个或三个或更多个这样的特性。此外，在L-氨基酸生产细菌的育种中，可以单 独增强L-氨基酸生物合成酶中的一种的活性，或可以组合增强这些酶中的两种或三种或 多种的活性。此外，给予如营养缺陷型、类似物抗性和代谢调控这样的特性可以结合增强生 物合成酶的活性。
[0078] 可以通过将亲本菌株或野生型菌株接受通常的诱变处理，并且随后从所获得的突 变菌株中选择呈现出营养缺陷型、类似物抗性或代谢调控突变并且具有L-氨基酸生产能 力的菌株，从而获得具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷型突变菌株、L-氨基酸类似物抗性 菌株或代谢调控突变菌株。通常的诱变处理实例包括X-射线或紫外线照射和使用突变剂 的处理，所述突变剂如N-甲基-Ν' -硝基-N-亚硝基胍（MNNG)、乙基甲烷磺酸酯（EMS)和 甲基甲烷磺酸酯（MMS)。
[0079] 还可以通过增强目标L-氨基酸的生物合成中涉及的酶的活性来给予或增强L-氨 基酸生产能力。例如，可以通过修饰细菌，使得编码酶的基因的表达增强，从而来增强酶活 性。用于增强基因表达的方法描述于W000/18935、EP 1010755Α等中。之后将描述用于增 强酶活性的详细程序。
[0080] 此外，还可以通过降低催化产生目标L-氨基酸以外的化合物的目标L-氨基酸生 物合成路径的分支反应的酶的活性来给予或增强L-氨基酸生产能力。本文中涉及的"催化 产生目标L-氨基酸以外的化合物的目标L-氨基酸生物合成路径的分支反应的酶"包括涉 及目标氨基酸分解的酶。之后将描述用于降低酶活性的方法。
[0081] 以下，将具体举例说明L-氨基酸生产细菌和给予或增强L-氨基酸生产能力的方 法。所有L-氨基酸生产细菌的特性和用于给予或增强L-氨基酸生产能力的修饰可以独立 使用或以任意合适的组合使用。
[0082] 〈L-谷氨酸生产细菌〉
[0083] 用于给予或增强L-谷氨酸生产能力的方法的实例包括，例如，修饰细菌使得细菌 具有一种或多种选自L-谷氨酸生物合成酶的酶的提高活性的方法。这样的酶的实例包括， 但不特别限于，谷氨酸脱氢酶（gdhA)、谷氨酰胺合成酶（glnA)、谷氨酸合成酶（gltBD)、异 柠檬酸脱氢酶（icdA)、乌头酸水合酶（acnA、acnB)、柠檬酸合成酶（gltA)、甲基柠檬酸合 成酶（prpC)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（ppc)、丙酮酸羧化酶（pyc)、丙酮酸脱氢酶（aceEF、 lpdA)、丙酮酸激酶（pykA、pykK)、磷酸稀醇丙酮酸合成酶（ppsA)、稀醇酶（eno)、磷酸甘 油酸变位酶（pgmA、pgml)、磷酸甘油酸激酶（pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gapA)、磷酸丙 糖异构酶（tpiA)、二磷酸果糖醛缩酶（fbp)、磷酸果糖激酶（pfkA、pfkB)、磷酸葡糖异构酶 (pgi)、6_磷酸葡糖脱氢酶（edd)、2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖醛缩酶（eda)和转氢酶。在 酶的名称后面的括号中显示的是编码该酶的基因（应当同样适用于下文中的相同情况）。 在这些酶中，优选增强一种或多种选自例如谷氨酸脱氢酶、柠檬酸合成酶、磷酸烯醇丙酮酸 羧化酶和甲基柠檬酸合成酶的酶的活性。
[0084] 属于肠杆菌科并且修饰使得柠檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和/ 或谷氨酸脱氢酶基因的表达提高的菌株的实例包括EP 1078989A、EP955368A和EP952221A 中公开的那些。此外，属于肠杆菌科并且修饰使得Entner-Doudoroff路径（edd、eda)的基 因的表达提高的菌株的实例包括EP1352966B中公开的那些。
[0085] 用于给予或增强L-谷氨酸生产能力的方法的实例还包括，例如，修饰细菌使得细 菌具有一种或多种酶降低的活性，所述酶选自催化产生L-谷氨酸以外的化合物的L-谷 氨酸生物合成路径的分支反应的酶。这样的酶的实例包括，但不特别限于，异柠檬酸裂解 酶（aceA)、α-酮戊二酸脱氢酶（sucA)、磷酸转乙酰酶（pta)、乙酸激酶（ack)、乙酰醇酸 合成酶（ilvG)、乙酰乳酸合成酶（ilvl)、甲酸转乙酰酶（pfl)、乳酸脱氢酶（Idh)、醇脱氢 酶（adh)、谷氨酸脱羧酶（gadAB)、琥?自酸脱氢酶（sdhABO))和l-pyroline-5-羧酸脱氢酶 (putA)。在这些酶中，优选降低或删除例如α-酮戊二酸脱氢酶活性。
[0086] 具有降低的α -酮戊二酸脱氢酶活性或缺乏α -酮戊二酸脱氢酶活性的埃希氏 菌属细菌及其获得方法描述于美国专利No. 5, 378, 616和5, 573, 945。此外，用于降低或删 除肠杆菌科细菌（如，泛菌属细菌、肠杆菌属细菌、克雷伯氏菌属细菌和埃文氏菌属细菌） 的α -酮戊二酸脱氢酶活性的方法公开于美国专利No. 6, 197, 559、6, 682, 912、6, 331，419、 8, 129, 151和W02008/075483中。具有降低的α -酮戊二酸脱氢酶活性或缺乏α -酮戊二 酸脱氢酶活性的埃希氏菌属细菌的特定实例包括以下菌株。
[0087] 大肠埃希氏菌 W3IIOsucA: : Kmr
[0088] 大肠埃希氏菌 AJ12624 (FERM ΒΡ-3853)
[0089] 大肠埃希氏菌 AJ12628 (FERM ΒΡ-3854)
[0090] 大肠埃希氏菌 AJ12949(FERM BP-4881)
[0091] 大肠埃希氏菌W3110sucA: =Kmlr是通过破坏编码大肠埃希氏菌W3110的α -酮戊 二酸脱氢酶的sucA基因获得的菌株。该菌株完全缺乏α -酮戊二酸脱氢酶活性。
[0092] L-谷氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括泛菌属细菌，如菠 萝泛菌AJ13355菌株（FERM ΒΡ-6614)、菠萝泛菌SC17菌株（FERM ΒΡ-11091)和菠萝泛菌 SC17(0)菌株（VKPM B-9246)。AJ13355 菌株是从 Iwata-shi，Shizuoka-ken，日本的土壤中 分离的菌株，作为可以在含有L-谷氨酸和碳源的低pH培养基中增殖的菌株。SC17菌株是作 为低粘液-生产突变菌株从AJ13355菌株选择的菌株（美国专利No. 6, 596, 517) JC17菌株 于2009年2月 4 日保藏在独立的管理机构，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary(目前为独 立的管理机构，National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary， #120,2-5_8Kazusakamatari， Kisarazu-shi， Chiba-ken， 292-0818,日本），并且指定了 FERM BP-11091的保藏号。AJ13355菌株于1998年2月 19 日保藏在 National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science an