用于生产萜烯的方法
【专利说明】用于生产萜烯的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及用于在真菌中生产萜烯的方法、修饰的萜烯生物合成基因簇、以及构 巢曲霉（Aspergillus nidulans)用于生产多种类型的猫稀的用途。
[0002] 相关领域的描述
[0003] 萜烯是具有多种药学和工业应用的一大类化合物。萜烯可作为潜在的药物或药 物前体、生物活性化合物或燃料和化学品。这些应用的实例是抗疟的倍半萜紫穗槐二烯 (amorphadiene)、抗癌的二猫紫杉醇和倍半猫法呢稀，其可作为燃料和作为化学品的前体。 单萜，例如柠檬烯，具有作为喷气燃料成分的应用。
[0004] 萜烯是从宽范围的生物体中的五碳前体分子合成的一类生物生成的分子。萜烯是 纯的碳氢化合物，而萜类化合物可含有一个或多个氧原子。术语萜烯和萜类化合物可互换 使用。萜类化合物仅在植物和某些微生物中少量天然产生。然而，微生物生产是生产多种 萜烯的吸引人的替代。尤其是真菌具有低营养需求，可以抵抗木质纤维素水解产物上的抑 制剂，能够使用多种碳源，并且也适合大规模生产，因此提供了所探求的成本合算的方式以 生产萜烯化合物。已经通过在异源/组成型启动子下的途径中表达某些基因而工程改造了 若干微生物，用于萜烯生产。
[0005] 这些经遗传改造的微生物宿主中的一个问题就是因生物体中存在的天然活性所 致的低产量的结果或产生副产物。
[0006] 编码生物合成途径中的连续步骤的基因倾向于在染色体上簇集在一起形成"基因 簇"。簇集程度在生物体内部和之间是高度可变的。次级代谢物是对生物体正常生长而言 并非必需的化合物。它们的作用是在生态相互作用中作为防御化合物或信号转导分子。许 多次级代谢物都具有吸引人的生物学性能，例如作为抗生素、抗癌药、杀虫剂、免疫抑制剂 和除草剂。在细菌中，控制这些化合物的生物合成的基因簇集在事实上是很普遍的。然而， 真核基因组也含有功能相关的、但并非同源的基因簇[Osbourn，2010]。
[0007] 很多用于次级代谢物合成的簇可以在丝状真菌中找到。与从先前鉴定的代谢物所 预测的基因簇相比，丝状生物包含多得多的用于次级代谢物生物合成的基因簇。次级代谢 的基因簇是用于代谢物生产的自含式的盒。它们含有编码产生不同类型的次级代谢物的骨 架结构的酶的基因，所述酶例如非核糖体肽合成酶（NRPS)酶、聚酮合酶（PKS)和萜烯合酶， 其称为"标签"基因/酶。这些簇也含有用于修剪修饰次级代谢物骨架的酶的基因，所述酶 例如氧化还原酶、甲基转移酶、酰基转移酶和糖基转移酶。在某些情况下，次级代谢簇也包 括用于途径-特异性调节剂的基因和/或途径终端产物抗性的基因[Osboum，2010]。
[0008] 次级代谢簇的表达通常处于环境和/或发育控制之下并且是由复杂的调控级联 所介导，所述级联将信号传递给途径-特异性开关。Zn (II) 2Cys6-型转录因子的作用是通 过上调簇集基因的转录而作为次级代谢物簇的途径-特异性激活物。次级代谢物基因的簇 集具有在染色质水平上促进调控的潜力。某些次级代谢物簇内的基因的特定顺序和位置可 提供有助于确定基因活化的时间和顺序的结构框架。已经提出该过程组织贯穿途径中的酶 步骤的连续的底物通道[Roze等人，2007]。功能相关基因的簇集的优势是需要共同调节生 物合成或发育途径中的一组基因控制的连续步骤。簇集促进了一组生物合成基因的最佳调 控。
[0009] 已经证实基因间隔区和染色体定位在优化基因表达中起作用。许多次级代谢物簇 位于染色体的亚端粒区，其中异染色质转录受到位置调控。位于亚端粒区的某些簇显示出 受到通用转录激活物例如LaeA或AreA的调节，其响应环境刺激以释放异染色质区用于翻 译。在这些区中的基因转录在正常生长条件下沉默。当外源基因随机整合到宿主生物的基 因组上时，位置转录调控可在靶基因的基因表达中发挥作用[Palmer等人，2010]。
[0010] 除了随机整合的转化DNA造成的基因破坏所导致的不可预见的多效性外，已经提 出某些染色体位置比其他位置更加有利于异源表达，也许是因为与局部调节元件的特定相 互作用，或更常见的是在正常高度表达的基因附近的活性天然转录[Davis等人，1991]。当 从其原始基因座上被取代时，某些在空间或时间上被调控的曲霉基因，例如黄曲霉毒素簇 [Chiou等人，2002]和分生孢子-特异性基因[Miller等人，1987]，显示出在调控反应中的 巨大变化，并且也已报道了对异源表达的基因座作用[Verdoes等人，1995]。
[0011] 在Lubertozzi & Kiesling发表的论文中，将来自黄花蒿（Artemisia annua)的 紫穗槐二烯合酶基因转化到构巢曲霉中。在他们的方法中，与在大肠杆菌中相同的表达实 验相比，在构巢曲霉中的产物特异性大大降低。猜测其原因为其它构巢曲霉次生代谢产物 基因的干扰背景活性，而大肠杆菌中不存在这些基因，或者缺乏将萜类化合物碳骨架修饰 为紫穗槐二烯所需的支持性酶活性。
[0012] Bok等人公开了在构巢曲霉中IaeA的过表达诱导许多次级代谢物簇，包括推定的 萜类化合物簇。
[0013] WO 2002024865(Holzman)描述了使用位于洛伐他汀簇之外的Zn2(II)Cys6-转录 激活物对洛伐他汀生产的调节。
[0014] WO 2001 021779 (DSM)公开了在丝状真菌中激活β-内酰胺生产的簇特异性转录 激活物BlaR的鉴定、克隆和过表达。
[0015] WO 1999 025735描述了嵌合转录因子的过表达，以增加次级代谢物的产生。
[0016] Sakai等人已将红曲霉（Monascus)的橘霉素生物合成基因簇引入米曲霉 (Aspergillus oryzae)中。他们通过进一步引入由曲霉trpC启动子控制的多拷贝的激活 物基因 CtnA而能够增加橘霉素的产量。
[0017] Chiang等人已经能够通过用诱导型启动子取代转录激活物的启动子而在构巢曲 霉中活化其它沉默聚酮簇。
[0018] WO 2006 014837提出了具有例如不同萜烯合酶的宿主细胞的遗传修饰，以获得类 异戊二烯前体或类异戊二烯化合物。
[0019] WO 2010104763公开了使用编码萜烯合酶的核酸生产萜烯和萜类化合物。该发明 描述了在调节区（启动子）下的基因表达，但不用基因簇。
[0020] 同样，WO 2008039499公开了包含编码萜烯合酶的核苷酸序列的核酸，WO 0240694 公开了具体包含紫杉烷合成途径的表达载体，WO 2007140339公开了经由生物合成途径生 产类异戊二烯。
[0021] US 2009/0137014 Al描述了用微生物从乙醇中生产紫穗槐-4,11-二烯或法呢 稀。W008133658描述了通过酿酒酵母和大肠杆菌从糖类中生产单猫。有若干其它专利/专 利申请，例如WO 2008045555,其中使用微生物生产法呢烯。
[0022] 也描述了在工程化微生物中生产单猫（Carter，Peters & Croteau2003)。他们 发现表达来自绿薄荷的柠檬烯合酶的大肠杆菌，生产低浓度的柠檬烯。通过在大肠杆菌 中过表达来自挪威云杉（Picea abies)的单猫环化酶3-蒈稀环化酶，形成单猫梓檬稀、 α-薇稀、月桂稀、桧稀、3-蒈稀、α-猫品稀、β-水序稀、α-猫品稀和猫品油稀的混合物 (Reiling 等人· 2004)。
[0023] 倍半猫的生物合成的生产也描述于Kimura Μ.等人（2007)。
[0024] 因此，用于生产萜烯的生物合成途径是已知的。然而，所引用的出版物中无一公开 特别激活属于萜烯生物合成途径的基因簇的转录因子的过表达。尤其是，这些出版物都没 有教导替换簇的某些基因以获得不同的萜烯产物，或导致表达水平的改变。
[0025] 生物合成途径中的关键性基因的表达水平的平衡可以影响产物的结果和生物体 本身的活力。很多时候，基因产物的充足将导致对其表达的抑制。表征了许多这样的负反 馈环，例如Bergmann等人（2007)，其中描述了基因簇的单个基因的过表达通常导致对同一 簇的另一基因产物的限制。另外，中间体的积累可以负面调节特定途径的后续步骤。因此， 对于生物合成途径基因，最高可达到的基因表达不一定与所述途径的终产物的最高得率相 关。因此，重要的是发现负责生物合成中的特定步骤的各基因的最佳表达水平。通过使用 生物合成基因的引入启动子，这可能是困难的。
[0026] 现有技术解决方案的缺点在于难以获得萜烯的高产物得率。另外的缺点是通过微 生物发酵得到的产物通常包含大量不确定的副产物和其它不需要的化合物。另外，每个基 因都不得不具有自身的调节区（启动子）。总之，存在对获得较高得率的富集产物而无实质 量的副产物的萜烯生产方法的需求。
[0027] 本发明的目标和概述
[0028] 本发明目的是提供用于通过微生物发酵生产萜烯的方法，并具有将产物代谢物从 天然产生的某一种变为另一种的选项。优选地，同时使产物得率得以改善或者至少维持在 可接受水平，并且产物为富集的。特别地，目的是提供这样的方法，其中真菌固有的转录调 节能力用于将萜烯生物合成基因的转录调节维持在最佳水平，以在微生物宿主中生产多种 具有商业价值的萜烯化合物。
[0029] 这些和其它目的通过下文描述和要求保护的本发明来实现。
[0030] 本发明的第一方面是用于在真菌中生产萜烯的方法。该方法包括以下步骤：
[0031] (a)提供在宿主细胞中的修饰的萜烯生物合成基因簇，所述基因簇具有天然存 在的萜烯生物合成基因和启动子，其中一个或多个这些基因或启动子已被取代、截短或移 除；
[0032] (b)提供在所述宿主细胞中的转录因子，使得所述转录因子与天然或修饰的启动 子中的一个操作性连接以增加其表达，所述转录因子激活具有萜烯生物合成基因的修饰的 萜烯生物合成基因簇和与所述基因操作性连接的调节区；
[0033] (C)在允许所述激活簇的转录因子表达的条件下培养所述宿主；和
[0034] (d)任选回收由此产生的萜烯产物。
[0035] 依照该方面，提供具有生物合成基因簇的天然启动子、和任选能够激活所述修饰 的基因簇的合适转录因子的额外拷贝的宿主细胞。
[0036] 本发明的第二方面是修饰的萜烯生物合成基因簇。所述簇的特征在于其基本上包 含推定地编码以下的基因：
[0037] (a)Zn(II)2Cys6-型转录因子（AN1599);单萜合酶（例如γ-萜品烯合酶、柠檬 烯合酶、萜品油烯合酶、桉油醇合酶或水芹烯合酶或倍半萜合酶（例如α-法呢烯合 酶、紫穗槐二稀合酶、杜松稀合酶、石竹稀合酶或红没药稀合酶）或二猫合酶（例如ent-海 松 -8 (14)，15-二稀（ent-pimara-8 (14)，15-diene)合酶 AN1594、紫杉二稀合酶、贝壳杉稀 合酶、fusicoccadiene合酶、casbene合酶或松香二稀合酶）；GGPP_合酶（AN1592)或GPP 合酶或FPP合酶、HMG-CoA还原酶（AN1593)，和
[0038] (b)任选翻译延伸因子1-γ (AN1595)、细胞色素 P450(AN1598)、短链脱氢酶 (AN1596)、与甲基转移酶具有一些相似性的推定蛋白（AN1597)、与所述基因操作性连接的 调节区和任选AAA家族ATP酶（AN1591)和
[0039] (c)与条目（a)的基因和与条目（b)的任选基因操作性连接的调节区。
[0040] Zn (II) 2Cys6型转录因子（即AN1599)，是天然存在于萜烯生物合成基因簇内的转 录因子，能够调节位于该生物合成途径的所有基因。原本位于簇内部或与簇接近的转录因 子是优选的，这是因为其可被容易地鉴定。然而，转化到同源或异源宿主中后，插入的与簇 相关的转录因子的基因组位置不是关键性的。
[0041] 本发明的第三方面是用于在真菌中生产多种萜烯的如本文所述的修饰的萜烯生 物合成基因簇的调节区。
[0042] 本发明的第四方面是以SEQ ID NO :1或与SEQ ID NO :1具有至少80%同一性的 序列为特征的转录因子的用途。在一个优选的实施方案中，与SEQ ID NO :52的同一性程度 为82%、85%、87%、90%、92%、95%、98%或甚至99%。
[0043] 本发明的第五方面是构巢曲霉用于生产多种萜烯的用途。
[0044] 本发明第六方面是可用于本发明方法的生产宿主。根据本发明，所述宿主包含上 述的萜烯生物合成途径基因簇和任选引入的与启动子操作性连接的转录因子，其中一个或 多个基因或它们的启动子已被交换、截短或移除，其中所述转录因子能够激活萜烯生物合 成基因簇。在这方面使用的引入的与启动子操作性连接的转录因子意指，与未经修剪用于 本发明范围内的宿主相比，宿主细胞还携带（除可能的内源转录因子和启动子外）与启动 子操作性连接的转录因子的一个或多个拷贝。引入的转录因子和启动子可以是与宿主同源 或异源的。任选地，引入的与转录因子操作性连接的启动子可用于指导该转录因子的转录。 另外引入的启动子可以是与宿主同源或异源的。
[0045] 本文所述的所谓的"AN1599转化体"或"AN1599转化体菌株"或"oe :AN1599"是构 巢曲霉菌株，其具有处于组成型活性的gpdA-启动子下的Zn (II) 2Cys6转录因子AN1599的 额外拷贝。表达构建体的整合位点和拷贝数是未知的。本文所述的所谓的"gpdA > AN1599" 是构巢曲霉菌株，其具有靶向基因簇的组成型活性的gpdA-启动子以调节转录因子AN1599 的表达。
[0046] 术语"修饰的簇"意图指一个或多个基因或这些基因簇的调节区已被改变或移除。 因此，萜烯簇中的基因是可交换的。例如，可将萜烯合酶（AN1594)替换为任何单萜、二萜或 倍半萜的合酶以生产单萜、二萜或倍半萜。同样，GGPP-合酶（AN1592)基因可被GPP或FPP 合酶编码基因替换，以促进例如单萜合成。同样，可改变簇中的任何基因以促进优化的萜烯 生产。同样，可改变该簇的生物合成基因的任何启动子以促进优化表达。该方法得益于经 协调和调节的表达所致的簇组构。
[0047] 基因缺失的效应可有益于次级代谢物的生产。⑶Hl所编码的NADPH-依赖性谷氨 酸脱氢酶的缺失被认为是在酵母中改进倍半萜生物合成的最佳靶基因[Asadollahi]。也已 经报道了生物合成基因簇的单个基因的缺失以增加其它类型的次级代谢物的生产。在构巢 曲霉中，在DHMBA的生物合成基因簇中的细胞色素 P450基因缺失之后，提高了聚酮2,4-二 羟-3-甲基-6-(2-氧丙基）苯甲醛（DHMBA)的生产[Gerke]。诸如这些的修饰可用于本发 明。
[0048] 另外其它类型的修饰例如基因截短可增加萜烯生产。在酵母中，导致萜烯前体生 产的甲羟戊酸（MVA)途径经历了复杂的反馈调节，其中HMG-CoA还原酶作为主要调节靶标 [Dimster-Denk等人，1994]。HMG-CoA还原酶催化HMG-CoA向甲轻戊酸转化，并且在转录和 转录后水平上被调节。从酵母HMG-CoA还原酶同工酶I(HMGl)中移除N-末端调节结