一种卡贝缩宫素的纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及多肽反相HPLC技术领域，尤其是涉及一种批量化产业化纯化卡贝缩宫素的方法。
【背景技术】
[0002]卡贝缩宫素(Carbetocin)是一种合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物。像催产素一样，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力。对非妊娠得子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用，其临床和药物特性与天然产生的催产素类似。在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰。
[0003]不论是静脉注射还是肌肉注射卡贝缩宫素后，子宫迅速收缩，可在2分钟内达到一个明确强度。单剂量静脉注射卡贝缩宫素对子宫的活性作用可持续大约I个小时，因为足以预防刚生产后的产后出血。产后给予卡贝缩宫素后，在收缩的频率与幅度方面都比催产素要长，并且对有出血倾向、需要额外使用缩宫素者，卡贝缩宫素耐受性更好，与缩宫素一样有效甚至更有效。
[0004]目前临床常用的促进子宫收缩药物麦角新碱，会导致恶心、呕吐、高血压和冠脉痉挛等。卡贝缩宫素是一种长效的类催产素药物。与麦角新碱相比，使用卡贝缩宫素在预防阴道分娩妇女的产后出血方面同样有效，并且恶心、呕吐、高血压的发生比例显著降低。
[0005]因此卡贝缩宫素在临床有很好的应用前景，具有很高的开发价值。目前为止，很少有关于分离纯化的文献报道，特别是规模化生产的方法。现常用的纯化方法通常为凝胶法、离子交换等。主要缺点是方法单一，产品纯度低或者采取多种手段，产品收率低。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一条适于大规模工业化生产卡贝缩宫素的纯化工艺方法，解决现有技术分离方法单一，产品纯度低或者采取多种手段，产品收率低的技术问题。本发明使用反相高效液相色谱法纯化卡贝缩宫素，并用离子交换法交换转盐，生产成本低，工艺简单，环境污染低，收率高，便于工业化实施。
[0007]为实现上述目的，本发明的技术方案如下:一种纯化卡贝缩宫素的方法，包括如下步骤:
1)将卡贝缩宫素粗品溶液以0.45 μπι滤膜过滤，以固定相为十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱，流动相:高氯酸钠水溶液为A相，乙腈溶液为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；
2)将纯化后的高纯度肽溶液采用离子交换法转换成醋酸盐；
3)将最终的高纯度肽溶液减压旋蒸浓缩冷冻干燥，得粉末状成品肽。
[0008]更为优选的方案是:所述B相为色谱纯乙腈溶液。
[0009]更为优选的方案是:所述色谱乙腈溶液的质量百分浓度为10-50%，检测波长为220nm。
[0010]更为优选的方案是:所述的流动相中高氯酸钠的质量百分浓度为0.1%。
[0011]更为优选的方案是:所述的离子交换法采用阴离子交换树脂转盐，树脂型号为D314大孔吸附树脂。
[0012]本发明的有益效果是:本发明提出的一条适于产业化卡贝缩宫素的纯化工艺方法，利用离子交换法转盐，不仅能得到HPLC纯度大于99.0%的精肽，而且可以有效降低生产过程中有机溶剂的毒性，降低成本，从而达到大规模工业化生产的目的。
【具体实施方式】
[0013]实施例1
1.样品处理:在卡贝缩宫素氧化液中加入少许乙腈超声至液体澄清，用孔径为0.45um滤膜过滤后收集滤液备用。
[0014]2.纯化
纯化条件:色谱柱:以十八烷基硅胶键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为:5cmX25cm.流动相:A相:质量百分浓度0.1%高氯酸钠水溶液；B相:乙腈溶液。流速:60-80ml/min。检测波长:220nm。梯度:B% (质量百分浓度):10_50%，30_50min。进样量为
3.5_5g0
[0015]纯化过程:将色谱柱用质量百分浓度35%的B相平衡好后上样，上样量为1.5-2.0L样品溶液。线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用。
[0016]3.转盐，树脂型号为D314大孔吸附树脂树脂的预处理:
O甲醇清洗3-5次，
2)去离子水清洗3-5次，
3)0.2N的NaOH浸泡，并不时的搅拌，大约2个小时，
4)去离子水清洗至pH值为8左右，
5)甲醇清洗3-5次，
6)去离子水清洗3-5次，
7)加入质量百分比为10%醋酸水溶液浸泡，并不时搅拌，大约2小时左右，
8)去离子水清洗PH值为6左右；
在玻璃柱中加入预先处理好的树脂，将收集好的肽溶液加入柱中，交换比例质量比为5-10倍，调节液体流速为2-4滴/min，收集全部的目标峰。
[0017]4.将转盐后所得的所有肽溶液，进行减压浓缩至lg/50ml，浓缩温度不超过37°C，然后冷冻干燥得纯度大于99.0%的卡贝缩宫素，纯化收率78.2%。
[0018]实施例2
1.样品处理:在卡贝缩宫素氧化液中加入少许乙腈超声至液体澄清，用孔径为0.45um滤膜过滤后收集滤液备用。
[0019]2.纯化
纯化条件:色谱柱:以十八烷基硅胶键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为:1cmX 25cm.流动相:A相:质量百分浓度0.1%高氯酸钠水溶液；B相:乙腈溶液。流速:180-220ml/min。检测波长:220nm。梯度:B% (质量百分浓度):10_50%，30_50min。进样量为 10-15go
[0020]纯化过程:将色谱柱用质量百分浓度35%的B相平衡好后上样，上样量为4-5L样品溶液。线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用。
[0021]3.转盐，树脂型号为D314大孔吸附树脂树脂的预处理:
O甲醇清洗3-5次，
2)去离子水清洗3-5次，
3)0.2N的NaOH浸泡，并不时的搅拌，大约2个小时，
4)去离子水清洗至PH值为8左右，
5)甲醇清洗3-5次，
6)去离子水清洗3-5次，
7)加入质量百分比为10%醋酸水溶液浸泡，并不时搅拌，大约2小时左右，
8)去离子水清洗pH值为6左右，
在玻璃柱中加入预先处理好的树脂，将收集好的肽溶液加入柱中，交换比例质量比为5-10倍，调节液体流速为2-4滴/min，收集全部的目标峰。
[0022]4.将转盐后所得的所有肽溶液，进行减压浓缩至lg/50ml，浓缩温度不超过37°C，然后冷冻干燥得纯度大于99.0%的卡贝缩宫素，纯化收率77.8%。
[0023]实施例3
1.样品处理:在卡贝缩宫素氧化液中加入少许乙腈超声至液体澄清，用孔径为0.45um滤膜过滤后收集滤液备用。
[0024]2.纯化
纯化条件:色谱柱:以十八烷基硅胶键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为:15cmX25cm.流动相:A相:质量百分浓度0.1%高氯酸钠水溶液；B相:乙腈溶液。流速:650-850ml/min。检测波长:220nm。梯度:B% (质量百分浓度):10_50%，30_50min。进样量为 15-20go
[0025]纯化过程:将色谱柱用质量百分浓度35%的B相平衡好后上样，上样量为8-10L样品溶液。线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用。
[0026]3.转盐，树脂型号为D314大孔吸附树脂树脂的预处理:
O甲醇清洗3-5次，
2)去离子水清洗3-5次，
3)0.2N的NaOH浸泡，并不时的搅拌，大约2个小时，
4)去离子水清洗至pH值为8左右，
5)甲醇清洗3-5次，
6)去离子水清洗3-5次，
7)加入质量百分比为10%醋酸水溶液浸泡，并不时搅拌，大约2小时左右，
8)去离子水清洗PH值为6左右，
在玻璃柱中加入预先处理好的树脂，将收集好的肽溶液加入柱中，交换比例质量比为5-10倍，调节液体流速为2-4滴/min，收集全部的目标峰。
[0027]4.将转盐后所得的所有肽溶液，进行减压浓缩至lg/50ml，浓缩温度不超过37°C，然后冷冻干燥得纯度大于99.0%的卡贝缩宫素，纯化收率77.5%。
【主权项】
1.一种纯化卡贝缩宫素的方法，其特征是包括如下步骤: O将卡贝缩宫素粗品溶液以0.45 μπι滤膜过滤，以固定相为十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱，流动相:高氯酸钠水溶液为A相，乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液； 2)将纯化后的高纯度肽溶液采用离子交换法转成醋酸盐； 3)将最终的高纯度肽溶液减压旋蒸浓缩冷冻干燥，得粉末状成品肽。
2.根据权利要求1所述的一种纯化卡贝缩宫素的方法，其特征是:所述步骤I)中B相为色谱纯乙腈溶液。
3.根据权利要求1所述的一种纯化卡贝缩宫素的方法，其特征是:所述步骤I)中A相高氯酸钠的质量百分浓度为0.1%，梯度洗脱纯化B相的质量百分浓度为10-50%，检测波长为 220nmo
4.根据权利要求1所述的一种纯化卡贝缩宫素的方法，其特征是:所述的离子交换法是利用阴离子交换树脂转盐。
【专利摘要】本发明公开了一种利用反相高效液相色谱法纯化卡贝缩宫素的方法，解决现有技术分离方法单一，产品纯度低或者采取多种手段，产品收率低的技术问题。本发明包括如下步骤：1）将卡贝缩宫素粗品溶液以0.45μm滤膜过滤后待用，以固定相为十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱，流动相：质量百分浓度0.1%的高氯酸钠为A相，色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；2）利用离子交换法转成醋酸盐；3）将最终的高纯度肽溶液减压旋蒸浓缩冷冻干燥，得粉末状成品肽。本发明用于工业化生产卡贝缩宫素。
【IPC分类】C07K1-20, C07K7-16
【公开号】CN104744567
【申请号】CN201510107759
【发明人】徐红岩, 秦敬国, 杨翼
【申请人】上海吉尔多肽有限公司, 滨海吉尔多肽有限公司
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月12日