一种环孢菌素的合成方法

文档序号:8424840阅读:1045来源:国知局
一种环孢菌素的合成方法
【技术领域】
[0001]本发明属于药物合成技术领域,尤其涉及一种环孢菌素的合成方法。
【背景技术】
[0002]环孢菌素(又名环孢菌素A)是20世纪70年代发现的一组环状i^一肽物质,其中的环孢菌素A已作为高效免疫抑制剂广泛应用于器官移植,在世界市场的年销售额已达到10亿美元以上。环孢菌素作为高效免疫抑制剂广泛应用于器官移植术,它的问世引起了器官移植领域的一场革命,使尸体来源和活体来源肾移植一年的存活率分别从53%和78%提高到80%和90%,使肝移植患者5年的存活率从原来的20%提高到70%,并使心肺联合移植等手术得以广泛开展。除免疫抑制作用外,环孢菌素还有一系列其它生物活性,如治疗红斑狼疮、牛皮癣等自身免疫系统疾病,抑制HIV-1病毒,逆转肿瘤多药耐药等。
[0003]由于环孢菌素中含有多种N-甲基化氨基酸,难以用通用的多肽缩合试剂合成,目前环孢菌素的生产工艺均采用微生物发酵法,但是由微生物发酵法制备生产只能得到少数几种环孢菌素,难以构建药物筛选所需的大规模多肽化合物库。美国化学家丹尼雪夫斯基课题组在2010年尝试以异腈缩合反应在液相条件下合成环孢菌素A全序列。但是这种方法需要多种缩合试剂,并且在微波加热的条件下才能缩合成功,该制备工艺苛刻、难度高,因此难以推广应用于快速制备环孢菌素全序列。而目前还没有用固相多肽合成技术合成环孢菌素全序列的报道。

【发明内容】

[0004]本发明的目的在于提供一种环孢菌素的合成方法,旨在解决现有技术合成环孢菌素条件苛刻、难度高,且无法实现固相合成的问题。
[0005]本发明是这样实现的,一种环孢菌素的合成方法,包括以下步骤:
[0006]提供Fmoc基团保护的肼树脂;
[0007]米用三光气作为缩合试剂,固相合成H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-餅树脂;
[0008]将所述H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼树脂进行氧化活化处理,得到环孢菌素。
[0009]本发明提供的环孢菌素的合成方法,采用三光气作为缩合试剂,能在室温条件下将氨基酸的羧基直接转变为高活性的酰氯,从而使得环孢菌素的N-甲基化氨基酸能够在非常温和的条件下将氨基和羧基缩合成酰胺键,从而使固相合成环孢菌素全序列得以实现;同时,本发明采用金属制品作为环孢菌素固相合成的载体树脂,该树脂的特殊连接官能团,使得合成的 H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼树脂在氧化活化处理步骤中,可在切割的同时、直接将多肽两端游离的氨基和羧基首尾相连形成环肽,从而一步实现切割和闭环反应,简化了操作程序,同时避免了液相缩合成环过程中的多聚缩合副反应。
【附图说明】
[0010]图1是本发明实施例提供的环孢菌素合成方法流程示意图;
[0011]图2是本发明实施例提供的固相合成环孢菌素的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0012]为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
[0013]本发明实施例使用的英文缩写的含义如下:
[0014]BCT:三光气;
[0015]DCM: 二氯甲烷;
[0016]Fmoc:2,2,4,6,7_ 五甲基苯并呋喃;
[0017]NBS:N-溴代丁二酰亚胺;
[0018]DMF:N, N- 二甲基甲酰胺;
[0019]DIEA:N, N’ - 二异丙基乙胺。
[0020]本发明实施例提供了一种环孢菌素的合成方法,包括以下步骤,如图1所示:
[0021]S01.提供Fmoc基团保护的肼树脂;
[0022]S02.线形肽的合成:采用三光气作为缩合试剂,固相合成H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-餅树脂;
[0023]S03.环抱菌素的合成:将所述 H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVa1-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼树脂进行氧化活化处理,得到环孢菌素。
[0024]具体地,上述步骤SOl中,所述肼树脂为含有肼基的载体树脂,本发明实施例以肼树脂作为固相合成的载体树脂,一方面,提供了多肽固相合成所需的活性基团,更重要的是,米用餅树脂偶联得到的线性妝 H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼树脂,在进行下述步骤的裂解切割中,能直接将多肽两端游离的氨基和羧基首尾相连形成环肽,从而一步实现切割和闭环反应。
[0025]所述肼树脂的选择不受限制,本领域内常用的肼树脂均在本发明实施例的保护范围内。作为优选实施例,所述肼树脂可选用苯肼树脂。
[0026]上述步骤SOl中,所述肼树脂的替代度对后期环孢菌素组成氨基酸或氨基酸片段的偶联率会有一定的影响。当肼树脂的替代度过高时,反应基团在树脂上的密度过大,随着偶联的发生,多肽肽链逐渐增长,因此,其空间位阻会越来越大,这将增加后续氨基酸或氨基酸片段的偶联难度,导致部分肽链的偶联中断,从而降低了多肽合成的合成效率,浪费了原料,更重要的是,在后续的裂解切割过程中,这些被中断的肽链将连同环孢菌素一起切割下来,成为目的产物环孢菌素的杂质,且杂质类型多种多样,增加了环孢菌素的纯化难度;当肼树脂的替代度过低时,合成一定量的环孢菌素所需要的数值量将增加,从而提高了生产成本。为了同时解决上述问题,经过发明人反复研究发现,本发明实施例所述肼树脂的替代度为0.2?1.0mmol/go作为进一步优选实施例,所述肼树脂的替代度为0.2?0.6mmol/g°
[0027]在进行步骤S02前,上述肼树脂需要进行溶胀处理,所述溶胀处理采用二氯甲烷试剂进行。溶胀处理方法不受限制,本领域常用方法均在本发明实施例保护范围内。
[0028]为了避免上述肼树脂在偶联氨基酸或氨基酸片段前,其反应基团发生化学反应失效,应采用Fmoc保护基团将所述肼树脂进行保护。
[0029]上述步骤S02 中,所述固相合成 H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼树脂的步骤中,为了节省生产成本,在所述Fmoc基团保护的肼树脂上可采用逐一偶联的方式依次偶联Fmoc基团保护的D_Ala、MeLeu、Meleu、MeVal、MeBmt、Abu、MeGly、MeLeu> Val、Meleu、Ala合成线性肽。当然,也可以根据实际需要,将合成得到的满足环孢菌素序列的氨基酸片段进行Fmoc保护后,再在所述Fmoc基团保护的肼树脂上依次偶联Fmoc保护的氨基酸片段。上述氨基酸片段的组合形式及其个数不受限制,只需符合环孢菌素的氨基酸序列即可。本发明实施例中,为了降低环孢菌素的合成成本,优选采用逐一偶联氨基酸的方式合成 H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-餅树脂。本发明实施例中,上述固相合成H2N-Ala-MeLeu-Val-MeLeu-MeGly-Abu-MeBmt-MeVal-MeLeu-MeLeu-D-Ala-肼树脂的步骤中,在每次偶联氨基酸或氨基酸片段时,需将连载树脂上的反应基团或已部分偶联的氨基酸肽链进行去除Fmoc保护处理,本发明实施例中,所述Fmoc基团保护的去除试剂为含体积分数为20%的哌啶的DMF。所述处理方式不受限制,本领域常用的去除Fmoc保护处理均能用于本发明实施例。
[0030]本发明实施例中,由于所要合成的环孢菌素中含有7个N-甲基化的氨基酸,通用的多肽缩合试剂难以合成,其液相合成难度巨大,且多肽缩合试剂需要的种类多,固相合成更是难以企及。因此,环孢菌素的合成停滞在微生物发酵法。有鉴于此,发明了经过反复的实验、摸索,将用作液相反应介质的三光气作为本发明实施例多肽固相合成的缩合试剂。本发明实施例中,三光气能在室温条件下将氨基酸的羧基直接转变为高活性的酰氯,从而使得环孢菌素的N-甲基化氨基酸能够在非常温和的条件下将氨基和羧基缩合成酰胺键,从而使固相合成环孢菌素全序列得以实现。
[0031]上述固相合成步骤中,在所述Fmoc基团保护的肼树脂上逐一偶联氨基酸片段或单个氨基酸的方法不受限制,本领域内常用的多肽固相合成方法适用于本发明实施例。作为具体实施例,上述偶联反应的方法可以为将所述Fmoc基团保护的肼树脂加入到固相反应柱中,采用Fmoc去除试剂脱除Fmoc保护基后,用洗涤试剂进行清洗,洗涤试剂可采用本领域常用的洗涤试剂,如DMF、DCM等。取与肼树脂摩尔质量比为(1-3):1的
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