球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp及其表达载体、含有其基因的转基因植物的制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，具体涉及球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp及其表达载体、含有其基因的转基因植物的制备方法和应用。
[0002]
【背景技术】
[0003]在农业生产中，植物病害尤其是真菌病害一直是限制农作物产量提高的重要因素。目前主要采用化学农药作为防治病害的主要手段，但长期使用化学农药不仅导致病原菌产生抗药性，同时还造成生态环境的破坏。因此，抗病品种选育越来越受关注，成为植物病害的有效防治措施之一。然而，由于常规育种周期长、育种资源有限、病原菌变异迅速，因此不易获得抗性植株，难以满足生产的需要。随着生物工程技术发展，研宄者开始利用转基因技术，将外源抗病基因转入植物以提高植株的抗病性；这种方法具有选育速度快，易于获得抗性植株，且具有较好的遗传稳定性等优点，已成为获得抗病性植株的主要手段。但目前由于缺乏高效、广谱、持久的抗病基因，植物抗病基因工程在农业生产和商业上的应用受到很大限制；因此，获得高效、广谱的抗病基因，并分析其对植物抗病能力的影响是植物抗病基因工程的研宄重点。
[0004]昆虫病原真菌，如球孢白僵菌与金龟子绿僵菌，是控制自然界昆虫种群数量的主要因子，已被开发成生物农药，广泛用于农林害虫及城市卫生昆虫的防治。球孢白僵菌是我国应用范围较广的生防真菌，具有寄主范围广、毒力高等特点；目前的研宄显示，球孢白僵菌除能致病昆虫外，还能寄生于植物，拮抗植物病原真菌的生长，为植物提供保护。我们通过前期研宄，将来自球孢白僵菌的水解酶基因，如Bbchitl导入番茄及棉花中，显著提高了植株的抗病能力；这一研宄表明，球孢白僵菌可能是筛选获得高效抗病基因的重要来源。
[0005]
【发明内容】
[0006]针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供球孢白僵菌(及?awreriabassiana )的抗菌蛋白Bbafp，解决目前植物抗病基因工程缺乏有效抗病基因的问题；该抗菌蛋白具有抑制植物病原真菌生长的活性，并能提高植物材料的抗病性的功效。
[0007]本发明的另一个目的是提供含有上述抗菌蛋白Bbafp的成熟蛋白核苷酸序列的酵母表达载体及其构建方法。
[0008]本发明的再一个目的是提供球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表达菌株的制备方法。
[0009]本发明的又一个目的是提供含有上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的核苷酸序列的植物表达载体及其构建方法。
[0010]本发明还提供含有上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp基因的转基因植物的制备方法。
[0011]本发明又提供上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp在对植物病原真菌的抑菌方面的应用。
[0012]实现上述目的，本发明采用如下技术方案:球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp，该抗菌蛋白氮端为含有19个氨基酸的信号肽序列，羧基端为70个氨基酸的成熟蛋白区域；该抗菌蛋白具有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列和如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
[0013]球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表达载体，包括上述抗菌蛋白Bbafp的成熟蛋白核苷酸序列和酵母表达载体。
[0014]上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表达载体的构建方法，包括如下步骤: DBbafp的克隆:
以球孢白僵菌的cDNA为模版，利用引物Pl和P2，扩增Bbafp的成熟蛋白序列；所述成熟蛋白序列不包含信号肽；
其中，PCR 反应体系如下:2.5 μ? 10XLA buffer, 2 μ? dNTP Mix, 2.5 μ? 25 mmol/L的MgCl2溶液，10 Mmol/L的上下游引物各I μ?，(λ2 μ? LA Taq DNA聚合酶，I μ? cDNA模板，加水补至总体积为25 μ? ;其中Pl为上游引物，Ρ2为下游引物；LA Taq DNA聚合酶为5U/uL ;所述dNTP Mix为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的钠盐水溶液预混合的产品，其中，四种物质在dNTP Mix中的浓度均为2.5 mmol/L ;PCR反应参数为:95°C预变性5 min ;94°C变性30 s，56°C退火 30 sec，72°C延伸 I min，32 个循环；最后 72°C延伸 5 min ；
PCR反应后，回收Bbafp片段，约227bp，克隆进pEASY_Tl载体；经测序正确的载体命名为 pEASY-Bbafp ；
所述引物Pl和P2序列如下:
Pl:51 - gaattcacccctgagcaatttgaggc-3'；
P2:5? - gcggccgcctagtggcacacgacagctcggc -3'；
其中，Pl的下划线部分为EcoRI序列，P2的下划线部分为NotI序列；
2)Bbafp的酵母表达:
用EcoR I和Not I双酶切步骤I)构建的pEASY-Bbafp载体，回收Bbazf片段，克隆进相同EcoR I和Not I双酶切的酵母表达载体，获得上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表达载体。
[0015]球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表达菌株的制备方法，将上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的酵母表达载体，转化入酵母中，经筛选获得表达Bbafp的酵母表达菌株。
[0016]球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的植物表达载体，包括上述抗菌蛋白Bbafp的全部核苷酸序列和植物表达载体。
[0017]上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的植物表达载体的构建方法，包括如下步骤:以野生型球孢白僵菌的cDNA为模板，引物PBbafp-pexl和PBbafp-pex2，扩增出Bbafp的全长片段，包括其氮端的信号肽序列；
PCR 反应体系:2.5 μ? 1XLA buffer, 2 μ? dNTP Mix, 2.5 μ? 25 mmol/L 的 MgCl2S液，10 Mmol/L 的 PBbafp-pexl 和 PBbafp_pex2 各 I μ?，0.2 μ? LA Taq DNA 聚合酶，I μ?cDNA模板，加水补至总体积为25 μι;所述LA Taq DNA聚合酶为5 U/uL;所述dNTP Mix为dATP, dCTP、dGTP和dTTP的钠盐水溶液预混合的产品，其中，四种物质在dNTP Mix中的浓度均为2.5 mmol/L ;PCR反应参数为:95°C预变性5 min;94°C变性30 s，56°C退火30 sec，72°C延伸I min，32个循环；最后72°C延伸5 min ；
扩增反应后，回收Bbafp片段，克隆进pEASY-Tl载体，获pEASY-fBbafp ;用BamHI与EcoRI酶切pEASY-fBbafp，回收Bbafp片段，并克隆进相同BamHI与EcoRI酶切的植物表达载体，获得上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的植物表达载体；
所述引物PBbafp-pexl和PBbafp-pex2的序列如下:
PBbafp-pexl:cg^gatccatgcagattatttccatcgc ；
PBbafp-pex2:cg￡aattcctagtggcacacgacagctc ；
其中，PBbafp-pexl的下划线序列为BamHI序列，PBbafp-pex2的下划线序列为EcoRI序列。
[0018]含有球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp基因的转基因植物的制备方法，将上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的植物表达载体转化入根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，经验证获得Bbafp的根癌农杆菌转化子，并进行植物遗传转化，获得含有球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的转基因植物。
[0019]球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp的应用，上述球孢白僵菌抗菌蛋白Bbafp在对植物病原真菌的抑菌方面的应用。
[0020]相比现有技术，本发明具有如下有益效果:
1、本发明发现球孢白僵菌在受到植物病原真菌拮抗时会产生一种抗菌