一种对任意核酸实施靶向切割的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种对任意核酸实施靶向切割的方法。
【背景技术】
[0002] 分子生物学中对核酸的靶向切割常常使用限制性内切酶，限制性核酸内切酶是一 种能催化核酸断裂的酶，只对一定碱基序列中的一定位置发生作用。限制性内切酶主要分 成三大类，其中II型限制性内切酶能识别专一的核苷酸序列，并在该序列中或者序列外的 固定位置切割双链，产生粘性或平头末端，是常用的工具酶。尽管目前有超过3700种限制 性内切酶被开发，却只能识别300种不同的核酸序列，很难满足科研和应用的需要，因此， 数种拓展可被识别序列范围的方法应运而生。
[0003] 第一种研究思路，是将现有限制性内切酶的关键氨基酸突变，使其本身的识别切 害I]特性发生变化，得到不同性质的限制性内切酶，从而识别并切割不同序列。
[0004] 第二种研究思路，是将不同限制性内切酶的识别功能域、切割功能域交叉互换，彼 此排列组合，形成新的限制性内切酶，从而识别并切割不同序列。
[0005] 第三种研究思路，是通过频繁变更内切酶中的具有序列识别活性的功能域，实现 对多种序列的识别。锌指蛋白核酸内切酶（ZFNs)就是这样一种酶，ZFNs的非特异性核酸 切割域源自FokI酶C端196个氨基酸肽段，与切割功能域相连的识别域是由一系列锌指 蛋白串联组成，每个锌指蛋白特异性识别并结合一个特异的三联体碱基，锌指蛋白中alpha 螺旋的16个氨基酸决定了锌指蛋白的DNA结合特异性，因此不同的锌指蛋白可以识别并结 合不同的核酸序列，通过更换锌指蛋白就可以实现对不同序列核酸底物的识别切割。同时， 人们还研究出了转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs)，该酶与ZFNs的区别在于用转录 激活因子样效应子代替了锌指蛋白。前者可以识别不同的单个碱基，后者只能识别不同的 三联体碱基，因此TALENs比ZFNs更加具有应用潜力。
[0006] 尽管ZFNs和TALENs实现了对许多不同序列的识别和切割，但其昂贵的价格、过 长的设计周期使得二者的广泛应用受到严重限制，原因在于，频繁变更内切酶中的功能域， 其过程十分复杂。更加严重的是，尽管理论上可以针对任何序列设计相应的ZFNs，实际上 ZFNs几乎只对G碱基含量较高的序列有较好的识别作用，这是因为锌指蛋白中富含精氨 酸，精氨酸和G碱基之间相互作用比精氨酸与其它碱基之间的作用力强。并且ZFNs的非特 异切割严重，常常错切导致细胞毒性。这些都证明通过频繁变更内切酶中具有序列识别活 性的功能域以实现对多种序列识别的方法有较大的局限性。
[0007] 为了提高通用性，降低成本，缩短设计周期，本发明引入了结构识别目的核酸的概 念，替代传统的序列识别目的核酸概念，通过一种能和目的核酸形成特殊结构的探针以及 一种可识别该结构的酶，实现对不同核酸的靶向识别切割。与频繁变更内切酶中的功能域 相比，变更探针更加节省时间和费用，具有较强的创新性、通用性以及应用价值。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对现有核酸切割技术的上述不足，提供一种对任意核酸实施靶 向切割的方法。
[0009] -种对任意核酸实施靶向切割的方法，根据目标核酸的靶位点，设计针对靶位点 的核酸探针；加入核酸探针，使其与目标核酸杂交，形成能够被一类识别核酸结构并具有切 割活性的酶识别的结构；在所述的识别核酸结构并具有切割活性的酶存在的情况下，对核 酸探针与目标核酸形成的杂交结构进行切割；对于序列不同的靶核酸，只需要更换对应的 核酸探针，无需更换酶，即可对任意序列核酸进行靶向切割。
[0010] 其中，所述的识别核酸结构并具有切割活性的酶为一种重组结构识别核酸内切 酶，包含识别功能域、切割功能域以及连接二者的肽段；所述的识别功能域为能够识别结构 为5'突出核酸结构、3'突出核酸结构、切刻核酸结构、侵入核酸结构、三链核酸结构、Y型 核酸结构以及由错配或缺失核酸引起的鼓泡核酸结构中的至少一种的识别功能域，优选 TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN、MthFEN、E.coliMuts、Tthmuts或Taqmuts 中任意一种酶的识别功能域或全酶片段；所述的切割功能域为IIS型核酸内切酶的切割功 能域，优选FokI的部分或全部肽段；所述的连接肽段为不影响结构识别与酶切功能的的 柔性肽段，优选甘氨酸或丝氨酸的串联组合。
[0011] 所述的识别核酸结构并具有切割活性的酶的氨基酸序列优选自SEQIDNO. 4、SEQ IDNO. 5、SEQIDNO. 6、SEQIDNO. 7、SEQIDNO. 8 中的任意一种。
[0012] 所述的核酸为DNA或RNA。
[0013] 所述的目标核酸为单链或者双链，当为双链时分别针对其中一条链的切割位置设 计探针。
[0014] 所述的核酸探针与靶核酸形成的结构包括5'突出核酸结构、3'突出核酸结构、切 刻核酸结构、侵入核酸结构、三链核酸结构、Y型核酸结构以及由错配或缺失核酸引起的鼓 泡核酸结构中的至少一种。
[0015] 一种重组结构识别核酸内切酶，该重组结构识别核酸内切酶由识别功能域、切割 功能域以及识别功能域和切割功能域之间的连接片段组成，所述的识别功能域为能够识别 二级结构为5'突出核酸结构、3'突出核酸结构、切刻核酸结构、侵入核酸结构、三链核酸结 构、Y型核酸结构以及由错配或缺失核酸引起的鼓泡核酸结构中的任意一种的肽段；所述 的切割功能域为IIS型核酸内切酶的切割功能域肽段；所述的连接片段主要由丝氨酸和甘 氨酸组成。
[0016]所述的识别功能域优选自TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN、 MthFEN、E.coliMuts、Tthmuts或Taqmuts中任意一种的部分或全部肽段；进一步优选 AfuFEN、TaqPol或Tthmuts中任意一种的部分或全部肽段；所述的切割功能域优选自FokI 的C端196个氨基酸残基；所述的连接片段优选自SEQIDNO. 1或SEQIDNO. 2中的任意 一种。
[0017] 所述的识别核酸结构并具有切割活性的酶的氨基酸序列优选自SEQIDNO. 4、SEQ IDNO. 5、SEQIDNO. 6、SEQIDNO. 7、SEQIDNO. 8 中的任意一种。
[0018] 本发明所述的5'突出核酸结构是指一种由两条长度不等的互补核酸构成的结构， 短核酸的5'端与长核酸的3'端平齐，长核酸的5'端长于短核酸的3'端，即长核酸的5' 端有部分处于单链状态，如图1所示；
[0019] 本发明所述的3'突出核酸结构是指由一种由两条长度不等的互补核酸构成的结 构，短核酸的3'端与长核酸的5'端平齐，长核酸的3'端长于短核酸的5'端，即长核酸的 3'端有部分处于单链状态，如图2所示；
[0020] 本发明所述的切刻核酸结构是指一种由两条互补核酸组成的结构，其中一条核酸 的两个相邻碱基之间缺少磷酸二脂碱，如图3所示；
[0021] 本发明所述的Y型核酸结构是指一种由两条部分互补的核酸组成的结构，两条核 酸的一段完全互补，另一端不互补，形成Y型，如图4所示；
[0022] 本发明所述的侵入核酸结构是指一种由上游探针、下游探针以及模板探针组成的 结构，上、下游探针均与模板互补，DNA双链中上游探针侵入下游双链至少一个碱基形成的 如图5所示的结构；
[0023] 本发明所述的错配或缺失核酸引起的鼓泡核酸结构是指由两条不完全互补的核 酸所组成的结构，其中因为错配或者缺失的碱基而形成一个或若干碱基的不匹配，称之为 鼓泡结构，如图6所示。
[0024] 有益效果：
[0025] 本发明方法对于不同的目标核酸，只需要更换对应