小麦肉桂醇脱氢酶基因dna序列扩增方法及其引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种小麦肉桂醇脱氢酶基因DNA序列扩 增方法及其引物。
【背景技术】
[0002] 小麦是世界各国重要的粮食作物之一，近年来，随着小麦产量的进一步提高，高产 与倒伏的矛盾日益突出，倒伏成了影响小麦产量的限制因素之一，对实现小麦高产高效构 成了严重威胁。在生产上，出现小麦倒伏现象轻者减产4~20%，重者减产30~40%。因 此，深入研宄小麦品种的抗倒伏性及其调控，改善高产品种的抗倒伏能力，对于实现小麦高 产稳产优质具有重要意义。
[0003] 有研宄表明，小麦倒伏是否发生主要取决于小麦茎杆特征。不同小麦品种的茎杆 木质素含量存在明显差异，茎杆抗折力大、倒伏指数小的品种，其茎杆木质素含量高，茎杆 木质素含量可以作为小麦品种抗倒伏性评价的一个重要指标。
[0004] 肉桂醇脱氢酶（cinnamylalcoholdehydrogenase，CAD)是木质素合成过程中关 键酶之一，催化木质素前体合成的最后一步反应，生成木质素单体的前体物质。
[0005] 克隆肉桂醇脱氢酶基因DNA序列及研宄该序列在品种间的差异对挖掘CAD基因等 位变异及抗倒伏新品种分子辅助选择具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 为了克服上述技术缺陷，本发明的一个目的是提供了一种小麦肉桂醇脱氢酶基因 DNA序列扩增方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 小麦肉桂醇脱氢酶基因DNA序列的扩增方法包括如下步骤：
[0009] 1)将小麦的肉桂醇脱氢酶基因的cDNA序列与其近缘物种的肉桂醇脱氢酶基因的 DNA序列进行比对，得到肉桂醇脱氢酶基因的保守区域序列，设计一对扩增引物，扩增其中 的第一内含子序列；
[0010] 2)根据步骤1)中获得的比对结果，设计一对扩增引物，扩增其中的第二内含子序 列；
[0011] 3)根据步骤1)中获得的比对结果，设计一对扩增引物，扩增其中的第三内含子序 列；
[0012] 4)将上述扩增出的三个内含子拼接，在拼接全长的首尾端设计一对扩增引物，通 过长PCR扩增方法扩增出小麦肉桂醇脱氢酶基因DNA序列全长，将上述扩增产物切胶回收， 纯化后测序检测。
[0013] 其中，上述步骤1)~3)中所述的小麦近缘物种包括但不限于玉米、水稻、大麦、黑 麦草或尚梁。
[0014] 本发明的一个优选方面，上述步骤1)中设计得到的扩增引物序列如下1)或2):
[0015] 1)序列表中SEQNO. 1和SEQNO. 2所示的序列；
[0016] 2)将所述1)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且 具有与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。
[0017] 上述步骤2)中设计得到的的扩增引物序列如下1)或2):
[0018] 1)序列表中SEQN0. 3和SEQN0. 4所示的序列；
[0019] 2)将所述1)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且 具有与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。
[0020] 上述步骤3)中设计得到的扩增引物序列如下1)或2):
[0021] 1)序列表中SEQN0. 5和SEQN0.6所示的序列；
[0022] 2)将所述1)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且 具有与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。
[0023] 上述步骤4)中设计得到的扩增引物序列如下1)或2):
[0024] 1)序列表中SEQN0. 7和SEQN0.8所示的序列；
[0025] 2)将所述1)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且 具有与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。
[0026] 本发明的另一个目的是提供了通过上述扩增方法所得到的小麦肉桂醇脱氢酶基 因DNA序列全长。
[0027] 本发明一个优选的方面，其序列是如序列表中SEQN0. 9所示的序列。
[0028] 本发明的再一个目的是提供了上述的小麦肉桂醇脱氢酶基因DNA序列全长在筛 选抗倒伏小麦分子育种上的应用。
[0029] 本发明还进一步提供了小麦肉桂醇脱氢酶基因DNA序列全长在制备抗倒伏转基 因小麦上的应用。
[0030] 本发明提供了上述的小麦肉桂醇脱氢酶基因DNA序列扩增方法，该方法能有效扩 增出CAD全长序列，并且操作简单，结果可信。本发明提供的扩增引物，能广泛适用于不同 品种的小麦，且扩增结果特异性强。该方法为克隆肉桂醇脱氢酶基因DNA序列及研宄该序 列在品种间的差异对挖掘CAD基因等位变异及抗倒伏新品种分子辅助选择具有重要意义。
【附图说明】
[0031] 图1为小麦近缘物种间的blast的结果示意图；
[0032] 图2-1和图2-2为小麦CAD基因的cDNA序列和水稻CAD基因的DNA序列的比对 结果图；
[0033] 图3是扩增出的CAD基因的第一内含子电泳结果图；其中，中间泳道是标记物， 1~4均是扩增后的内含子扩增条带；
[0034] 图4是扩增出的CAD基因的第二内含子电泳结果图；其中，最右泳道是标记物， 1~2均是扩增后的内含子扩增条带；
[0035] 图5是扩增出的CAD基因的第三内含子电泳结果图；其中，最右泳道是标记物， 1~2均是扩增后的内含子扩增条带；
[0036] 图6是扩增出的CAD基因的DNA全长电泳结果图；其中，最右泳道是标记物，1~6 均是扩增后的CAD基因的DNA全长扩增条带；
[0037] 图7-1和图7-2是用DNAMAN软件对小麦CAD基因的DNA序列与cDNA序列的比对 图。
【具体实施方式】
[0038] 以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本 发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
[0039] 实施例1
[0040]1)登陆Genebank搜索小麦CAD基因（GenBank登录号：GU563724. 1)，与玉米、 水稻、黑麦草以及二穗短柄草进行序列比对，比对结果见图1，其中小麦为cDNA序列，其它 为DNA，在图中黑色区域中的小黑点部分为变异区，其余部分表示序列基本相同的区域，即 可能的保守区。具体比对的信息以水稻为例，比对结果见图2-1和图2-2,从图2可以看 出内含子可能位于小麦cDNA的177bp、295bp、522bp左右。根据上述比对结果设计一对 扩增引物，其中上游引物cadl-f2为：5' -CGCAGCAGCAAGAGAAT-3' ；下游引物cadl-r2为： 5 '-ATCTTGACGACCTCGATCTG-3 '，用该引物，红皖3号小麦的DNA为模板扩增出CAD基因的第 一内含子序列，具体操作请参照常规的扩增步骤。
[0041] 在步骤1)中，所扩增的片段大小在2000bp左右，该片段的电泳图谱见图3,从该图 中可见，该引物能有效扩增，从该图中可见扩增后的条带大小为2000bp左右与预计大小一 致，用上海普洛麦格公司的PCR回收试剂盒切胶回收送测序，该片段的序列见序列表中的 SEQN0. 10所示，序列长度为2253bp。
[0042] 2)根据步骤1)中的比对结果，设计一对扩增引物，其中上游引物KL2F1为： 5' -GCAACCACAACTACTTACGAC-3' ；下游引物KL2R1 为：5' -GTAGGTGACGACTGACGAAT-3'，用该 引物，红皖3