用于在细菌表面呈递目的蛋白的dna分子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于在细菌表面呈递目的蛋白的DNA分子及其应用。
【背景技术】
[0002] 细菌表面呈递技术是运用DNA重组技术使外源的蛋白质或多肽以融合蛋白的形 式展示在细菌的表面，被展示的目标蛋白质或多肽可以保持相对独立的空间结构和生物活 性，因此重组细菌就具有了该蛋白质和多肽的功能。更为重要的是，利用细菌表面呈递技术 可以省去目标蛋白的提取纯化等一系操作，直接用细胞进行后续研究和应用，方便快捷、经 济实用。细菌表面展示系统呈现载体多样性，有细菌外膜蛋白和脂蛋白系统，冰晶核蛋白系 统和自体运输蛋白系统等。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种用于在细菌表面呈递目的蛋白的DNA分子及其应用。
[0004] 本发明提供的DNA分子，自上游至下游依次包括N端信号肽的编码序列、 Passenger结构域的编码序列和C端跨膜转运结构域的编码序列；所述N端信号肽如序列 表的序列2所示；所述Passenger结构域如序列表的序列3所示；所述C端跨膜转运结构域 如序列表的序列4所示。
[0005] 所述N端信号肽的编码序列可如序列表的序列1自5'末端第4-129位核苷酸所 示。所述Passenger结构域的编码序列可如序列表的序列1自5'末端第250-810位核苷 酸所示。所述C端跨膜转运结构域的编码序列可如序列表的序列1自5'末端第811-1650 位核苷酸所示。
[0006] 所述DNA分子中，在所述N端信号肽的编码序列和所述Passenger结构域的编码 序列之间，还可具有多克隆位点序列。所述多克隆位点序列可如序列表的序列1自5'末端 第199-249位核苷酸所示。
[0007] 所述DNA分子中，在所述N端信号肽的编码序列和所述多克隆位点序列之间，还可 具有蛋白标签的编码序列。所述蛋白标签具体可为His标签。所述蛋白标签的编码序列具 体可如序列表的序列1自5'末端第181-198位核苷酸所示。
[0008] 所述DNA分子具体如序列表的序列1所示。
[0009] 含有以上任一所述DNA分子的重组质粒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的 保护范围。
[0010] 所述重组质粒可为将以上任一所述DNA分子插入表达载体的多克隆位点得到的 重组质粒。所述重组质粒具体可为将以上任一所述DNA分子插入pET-22b(+)载体的多克 隆位点（如Ndel和Bpull02I酶切位点之间）得到的重组质粒pAutoDisplay。
[0011] 所述重组菌具体可为将以上任一所述重组质粒(如重组质粒pAutoDisplay)导入 宿主菌得到的重组菌。所述宿主菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌C41 (DE3)。
[0012] 本发明还保护以上任一所述的DNA分子或以上任一所述重组质粒的应用；所述应 用为在细菌表面呈递目的蛋白。所述细菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌C41(DE3)。所 述目的蛋白具体可为GFP蛋白或CotA蛋白。
[0013] 本发明还保护一种在细菌表面呈递目的蛋白的方法，包括如下步骤：
[0014] ( 1)在以上任一所述重组质粒中插入目的蛋白的编码基因，插入位点为所述N端 信号肽的编码序列和所述Passenger结构域的编码序列之间；
[0015] (2)将步骤（1)得到的质粒导入宿主细菌；
[0016] (3)培养步骤（2)得到的细菌，从而在细菌表面呈递所述目的蛋白。
[0017] 所述步骤（1)中，所述插入位点具体可位于所述DNA分子的多克隆位点序列中。
[0018] 所述步骤（2)中，所述宿主细菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌C41(DE3)。
[0019] 所示步骤（3)中，所述培养中包括IPTG诱导的步骤。所示步骤（3)中，所述培养的 方法具体如下：将步骤（2)得到的细菌接种至LB液体培养基，37°C培养至0D6(l(lnm=0. 8-1. 0， 然后加入IPTG并使其浓度为0. 2mM，继续37°C、220rpm振荡培养4小时。
[0020] 所述目的蛋白具体可为GFP蛋白或CotA蛋白。所述目的蛋白的编码基因具体可 为序列表的序列5所不的GFP基因或序列表的序列6所不的CotA基因。
[0021] N端信号肽通过Sec(Secretion)依赖途径运输融合蛋白通过细胞内膜到达周质 腔，信号肽被切掉。C端跨膜转运结构域在外膜上组装折叠成桶状结构。Passenger结构 域通过桶状结构形成的通道被输送到细菌表面。蛋白标签的作用是便于检测目的蛋白是否 呈递到细菌表面。多克隆位点序列便于不同异源蛋白表达载体的构建，以使操作过程简洁 方便。
[0022] 本发明的有益效果及优点如下：
[0023] ( 1)本发明提供的DNA分子实现将目的蛋白运输至细胞外膜和通过外膜分泌所需 要的所有信息都集中在其本身，不需要其它蛋白的辅助；
[0024] (2)本发明提供的DNA分子可用于各种目的蛋白的细菌表面呈递，具有非常良好 的通用性。
[0025] 采用本发明提供的DNA分子或方法将目的蛋白呈递到细菌表面，可用于全细胞生 物催化，例如将CotA蛋白呈递到大肠杆菌表面，可以作为具有降解多环染料功能的全细胞 生物催化剂。本发明为进一步开发应用于工业生产的全细胞生物催化剂打下了坚实的基 础。本发明在全细胞生物催化、环境生物吸附剂的开发、抗体制备等众多领域具有潜在的应 用价值。
【附图说明】
[0026] 图1为重组质粒pAutoDisplay的结构示意图。
[0027] 图2为实施例2中的Westernblot结果。
[0028] 图3为实施例2中的荧光照片。
[0029] 图4为实施例3中的Westernblot结果。
[0030] 图5为实施例3中的酶活检测结果。
【具体实施方式】
[0031] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0032]ABTS,英文全称为 2, 2 ' -Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6_sulfonic acid)diammoniumsalt,中文全称为2, 2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵 盐：Sigma，HPLC级纯度。pET_22b(+)载体：MerckNovagen，69744。大肠杆菌Oil(DE3): Lucigen,60442。Trypsin:Merck,108367。
[0033] 实施例1、重组质粒(细菌表面呈递载体）的构建
[0034] 1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子。
[0035] 序列表的序列1中，自5'末端第4-129位核苷酸为N端信号肽的编码序列，第 181-198位核苷酸为His标签（由六个组氨酸残基组成）的编码序列，第199-249位核苷酸 为多克隆位点序列，第250-810位核苷酸为Passenger结构域的编码序列，第811-1650位 核苷酸为C端跨膜转运结构域的编码序列。
[0036] 2、将步骤1合成的双链DNA分子插入pET-22b(+)载体的Ndel和Bpull02I酶切 位点之间，得到重组质粒pAutoDisplay。重组质粒pAutoDisplay的结构示意图见图1。
[0037] 实施例2、在细菌表面呈递绿色荧光蛋白（GFP蛋白）
[0038] 1、将序列表的序列5所示的GFP基因插入重组质粒pAutoDisplay的BamHI和Xhol 酶切位点之间，得到重组质粒pAutoDisp1ay-GFP。
[0039]2、将步骤1得到的重组质粒导入大肠杆菌C41 (DE3)，得到重组菌。
[0040] 3、将步骤2得到的重组菌接种至LB液体培养基，37°C培养至0D6(l(lnm=0. 8-1. 0,然后 加入IPTG并使其浓度为0. 2mM，继续37°C、220rpm振荡培养4小时。
[0041] 4、完成步骤3后，取两份菌液(每份400111)，41：、200(^离心10分钟，收集菌体， 每份菌体用200ylPBS缓冲液（pH7. 4)重悬。
[0042] 5、取一份步骤4得到的菌液，加入4iai0mg/mlTrypsin溶液然后37°C水浴10分 钟,然后迅速置于4°C并加入20ill胎牛血清以终止反应，然后2000g离心5分钟收集菌体， 然后用含l〇%FBS的PBS缓冲液（pH7. 4)洗涤3遍，然后用PBS缓冲液（pH7. 4)洗涤一遍，然 后用200iUPBS缓冲液（pH7. 4)重悬。
[0043] 6、取另一份步骤4得到的菌液，加入4iU PBS缓冲液（pH7.4)然后37°C水浴消化 10分钟，然后迅速置于4°C并加入20 ii 1胎牛血清以终止反应，然后2000g离心5分钟收集 菌体，然后用含10%FBS的PBS缓冲液（pH7. 4)洗涤3遍，然后用PBS缓冲液（pH7. 4)洗涤一 遍，然后用200ylPBS缓冲液（pH7. 4)重悬。
[0044] 7、分别取步骤5得到的菌液(实验组）和步骤6得到的菌液(对照组)，进行 12%SDS-PAGE和westernblot。采用的一抗为1:3000倍稀释的鼠源His抗体（Sigma， H1029)，采用的二抗为1:5000倍稀释的辣根过氧化氢酶标记的羊抗鼠二抗。
[0045]Trypsin消化的原理：在不破坏整个细胞的情况下，Trypsin可以将分泌至细菌表 面的蛋白消化，通过实验组和对照组的比较，可以判断该蛋白是否分泌到细菌表面，实验组 细菌表面的蛋白会被消化，Westernblot图谱中不显示目的条带，对照组细菌表面的蛋白 没有被消化，在Westernblot图谱中显示目的条带。
[0046] 序列1编码的融合蛋白中的C端跨膜转运结构域在外膜上组装折叠成桶状结构， Passenger结构域上游的片段(含Passenger结构域）通过桶装结构被输送到