用于检测细胞增殖性异常或疾病程度分级的基因组合物及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因检测，尤其涉及一种基因组合物及其将该基因组合物用于检测个 体中细胞增殖性异常或疾病程度的分级。
【背景技术】
[0002] 细胞增殖性异常性疾病，例如癌症是一个主要的公共健康难题，在美国，因癌症死 亡的人数约占总死亡人数的25%。其中，胃癌是全世界排名第四个最普遍被诊断的癌症，而 且在所有癌症中死亡率排名第二高，被视为全世界最大的健康克星之一。尤其在很多亚洲 国家，包括在中国，胃癌在各种恶性肿瘤中居首位，其发病率和死亡率均很高。
[0003] 而胃炎是胃粘膜炎症的统称，其常见于成人，许多病因可刺激胃，如饮食不当，病 毒和细菌感染、药物刺激等均可能引发，但比较容易纠正和治疗。
[0004] 但是胃炎症状和胃癌的症状一般容易混淆，使得日常生活中很多人常把胃炎误认 为是胃癌，整天担惊受怕，即便是不严重的病疾，也会因心理作用，持续恶化；有些人则把胃 癌误当成胃炎，不把它当一回事，以为不严重，错失了治疗的最佳时机。
[0005] 因此，急需一种灵敏度高和特性高的检测方法以便于区分正常、胃炎和胃癌，尤其 急需一种灵敏度和特异性高，而且无痛的检测方法。
[0006] 而随着生物科技的不断发展，利用基因检测来诊断疾病的方法受到了广泛的瞩 目。其中DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，不仅在维持正常细胞功能，而且在癌 症和炎症发生中也起着重要的作用，即甲基化状态的改变是引起癌症和炎症的一个重要因 素，这种变化包括基因组整体甲基化程度降低和CpG岛局部甲基化程度的异常升高，从而 导致基因组的不稳定和抗病基因的不表达。如果抗病基因中有活性的等位基因失活，则发 生癌症以及炎症的机率提高。因此，甲基化的研究，为癌症和炎症的早期预测、分类、分级及 预后评估提供了新的依据，是目前的研究热点之一。
【发明内容】
[0007] 因此，本发明提出了一种用于通过检测DNA甲基化程度来对个体中细胞增殖性异 常进行检测或对疾病程度（例如胃癌和胃炎）进行分级的基因组合物、试剂盒及其用途，以 及该基于该试剂盒来执行检测的方法。
[0008] 相应地，根据本发明的第一个方面，提供了一种组合物，包括用于检测RNF180和 Septin9基因及其片段中至少一个靶区域内甲基化程度的核酸。
[0009] 典型地，所述核酸包括RNF180的至少15个寡核苷酸长片段，其中所述寡核苷酸包 含至少一个CpG二核苷酸序列。
[0010] 根据某些优选实施方式，所述RNF180的核苷酸长片段包含等同于、互补于或在中 等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQIDNo: 10至SEQIDNo: 12的至少15个核苷酸及其 互补序列。
[0011] 进一步优选的，所述RNF180的核苷酸长片段包含等同于、互补于或在中等严紧或 严紧条件下杂交于选自SEQIDNo:1至SEQIDNo:9的序列及其互补序列。
[0012] 典型地，所述组合物还包括将基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或 在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基的试剂。优选的，所述试剂是亚硫酸氢 盐。
[0013] 根据本发明的第二个方面，还提供了包括上述组合物的试剂盒。
[0014] 典型地，所述的试剂盒包括用于容纳患者生物样品的容器。
[0015] 并且，所述的试剂盒也可包括使用和解释试剂盒结果的说明。
[0016] 根据本发明的第三个方面，还提供了所述组合物在制备用于检测个体中细胞增殖 性异常的试剂盒中的用途。
[0017] 典型地，所述细胞增殖性异常是癌症。优选地，所述癌症是胃癌。
[0018] 根据本发明的第四个方面，还提供了一种对个体中细胞增殖性异常进行检测的方 法，所述方法包括：确定分离自所述个体的生物样品中RNF180和Septin9基因及其片段中 至少一个靶区域内甲基化程度，通过综合RNF180和S印tin9的甲基化检测结果来对个体中 细胞增殖性异常进行检测。
[0019] 典型地，所述方法还包括使用试剂以将基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化 为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基；使所述经试剂处理的 Septin9和RNF180基因或其片段与扩增酶和引物接触，使得所述经处理的基因或片段被扩 增以产生扩增产物或不被扩增；用探针检测扩增产物；以及基于所述扩增物是否存在，确 定S印tin9和RNF180的基因DNA序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化程度。
[0020] 典型地，所述引物包括RNF180的核苷酸长片段，所述RNF180的核苷酸长片段包含 等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQIDNo: 10至SEQIDNo: 12的 至少15个核苷酸及其互补序列。
[0021] 优选的，所述RNF180的核苷酸长片段包含等同于、互补于或在中等严紧或严紧条 件下杂交于选自SEQIDNo:1至SEQIDNo:9的序列及其互补序列。
[0022] 其中，优选的，用人造甲基化模板和非甲基化模板筛选所述引物和探针；或者，用 癌症和正常DNA做模板筛选所述引物和探针。
[0023] 典型地，所述个体的生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组 织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或 其组合。
[0024] 优选的，所述个体的生物样品为血浆。
[0025] 根据某些优选实施方式，所述S印tin9和RNF180的基因DNA序列的至少一个CpG 二核苷酸的甲基化状态是由聚合酶链式反应的循环阈值Ct值确定的。
[0026] 典型地，所述细胞增殖性异常是癌症。优选地，所述癌症是胃癌。
[0027] 相应地，根据本发明的另一个方面，提供了一种组合物在制备用于对个体的疾病 程度进行分级的试剂盒中的用途，所述组合物包括用于检测RNF180基因及其片段中至少 一个靶区域内甲基化程度的核酸，通过RNF180的甲基化检测结果来对疾病程度进行分级。
[0028] 根据本发明的某些优选实施方式，所述组合物进一步包括用于检测S印tin9基因 及其片段中至少一个靶区域内甲基化程度的核酸，通过综合RNF180和S印tin9的甲基化检 测结果来对疾病程度进行分级。
[0029] 典型地，所述核酸包括RNF180的至少15个寡核苷酸长片段，其中所述寡核苷酸包 含至少一个CpG二核苷酸序列。
[0030] 优选的，所述RNF180的核苷酸长片段包含等同于、互补于或在中等严紧或严紧条 件下杂交于选自SEQIDNo: 10至SEQIDNo: 12的至少15个核苷酸及其互补序列。
[0031] 进一步优选的，所述RNF180的核苷酸长片段包含等同于、互补于或在中等严紧或 严紧条件下杂交于选自SEQIDNo:1至SEQIDNo:9的序列及其互补序列。
[0032] 典型地，所述组合物还包括将基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或 在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基的试剂。优选的，所述试剂是亚硫酸氢 盐。
[0033] 典型地，所述疾病程度分为三级，第一级为正常，第二级为炎症，第三极为癌症。在 某些优选实施方式中，所述炎症为胃炎，并且所述癌症为胃癌。优选地，所述胃炎可进一步 分级为不易癌变的胃炎和容易癌变的胃炎。所述不易癌变的胃炎是浅表胃炎。进一步优选 地，所述容易癌变的胃炎可进一步分级为萎缩性胃炎和有肠化生胃炎。进一步优选地，所述 胃癌可进一步分级为I、II、III、IV期胃癌。
[0034] 根据本发明的另一方面，提供了一种对个体的疾病程度进行分级的方法，包括：确 定分离自所述个体的生物样品中RNF180基因及其片段中至少一个靶区域内甲基化程度， 通过RNF180的甲基化检测结果来对疾病程度进行分级。
[0035] 典型地，所述方法还包括：确定分离自所述个体的生物样品中S印tin9基因及其 片段中至少一个靶区域内的甲基化程度，通过综合RNF180和S印tin9的甲基化检测结果来 对疾病程度进行分级。
[0036] 根据某些优选实施方式，所述方法还包括：使用试剂以将基因的5位未甲基化的 胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基；使所述经 试剂处理的S印tin9和RNF180基因或其片段与扩增酶和引物接触，使得所述经处理的基因 或片段被扩增以产生扩增产物或不被扩增；用探针检测扩增产物；以及基于所述扩增物是 否存在，确定S印tin9和RNF180的基因DNA序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化程度。
[0037] 典型地，所述引物包括RNF180的核苷酸长片段，所述RNF180的核苷酸长片段包含 等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQIDNo: 10至SEQIDNo: 12的 至少15个核苷酸及其互补序列。
[0038] 优选的，所述RNF180的核苷酸长片段包含等同于、互补于或在中等严紧或严紧条 件下杂交于选自SEQIDNo:1至SEQIDNo:9的序列及其互补序列。
[0039] 其中，优选的，用人造甲基化模板和非甲基化模板筛选所述引物和探针；或者，用 癌症和正常DNA做模板筛选所述引物和探针。
[0040] 典型地，所述个体的生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组 织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或 其组合。
[0041] 优选的，所述个体的生物样品为血浆。
[0042] 根据某些优选实施方式，所述S印tin9和RNF180的基因DNA序列的至少一个CpG 二核苷酸的甲基化状态是由聚合酶链式反应的循环阈值Ct值确定的。
[0043] 典型地，所述疾病程度分为三级，第一级为正常，第二级为炎症，第三级为癌症。
[0044] 根据本发明的另一方面，还提供了一种核酸，所述核酸包括等同于、互补于或在中 等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQIDNo: 10至SEQIDNo: 12的至少15个核苷酸及其 互补序列。
[0045] 优选地，所述核酸包括等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ IDNo: 1至SEQIDNo:9的序列及其互补序列。
[0046] 在某些优选实施方式中，所述核酸用作检测RNF180基因及其片段中至少一个靶 区域内甲基化程度的引物和/或探针。
[0047] 根据本发明的另一方面，还提供了一种组合物，包含所述核酸，还包括将基因的5 位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他 碱基的试剂。优选地，所述试剂是亚硫酸氢盐。
[0048] 根据本发明的另一方面，还提供了一种包含上述组合物的试剂盒。典型地，所述试 剂盒包括用于容纳患者生物样品的容器。并且，所述试剂盒也可包括使用和解释试剂盒结 果的说明。
[0049] 本申请中，通过实验发现胃炎和胃癌中的RNF180基因的甲基化程度存在一个较 大的差异，RNF180在正常人组、慢性浅表性胃炎组、慢性萎缩性胃炎（包括慢性胃炎并发肠 化生）组、胃癌组I到IV期含量是逐渐增加的，Ct值逐渐下降。阳性率也按同样顺序由正 常人组到胃癌组逐渐上升，所以本申请提供了一种通过测试样本中的RNF180基因的甲基 化程度来对胃癌和胃炎进行分级的方法，从而提供了一种无创的、快速的胃癌和胃炎筛选 方法。
[0050]S印tin9和RNF180结合在一起检测胃癌，并和胃癌分期（I-IV)相关。RNF180还 能检测胃炎，分为正常组、胃炎组和胃癌组，三组之间均有显著的统计学差异。并且，RNF180 还能区别检测胃炎中有肠化生的胃炎和无肠化生的普通胃炎情况，有肠化生的RNF180是 100%阳性，普通胃炎约27%阳性。
[0051] 申请人还发现：随着年龄的增长，外周血中甲基化的RNF180基因含量呈增高趋 势，但由于年纪大的长者均多多少少会有一定程度的胃炎，难以区分开是年龄的因素还是 胃炎的因素导致外周血中甲基化的RNF180基因含量升高，从而对于胃炎和胃癌的检测的 特异性和可靠性带来很大影响。因此，考虑到这一因素，在检测中同时加入Septin9,因为 Septin9基因受年龄和胃炎影响的因素可以忽略不计，从而可以用Septin9来确认胃癌的 检测。具体而言，大约有40 %的胃癌是S印tin9和RNF180同时阳性，用两者同时阳性做判 断标准，可达到90%的特异性。Septin9的甲基化检测能够克服和弥补单独使用RNF180的 甲基化检测时特异性欠佳的不足，更加如实的表明细胞增殖性异常的存在。并且，根据某些
【具体实施方式】，一些胃癌的RNF180是阴性，而S印tin9是阳性，用S印tin9可以对这一部分 的胃癌进行检测，可增加约3%的灵敏度。Septin9的甲基化检测能够克服和弥补单独使用 RNF180的甲基化检测时灵敏度欠佳的不足，更加如实的表明细胞增殖性异常的存在。因此， 通过联合利用S印tin9和RNF180这两个生物标记物来对胃炎和胃癌进行分级，灵敏度和特 异性均可以得到提高。
[0052] 最后，通过利用实时PCR分析血浆样本中的DNA的方法，能方便地实现针对 S