刺参bpi基因、编码蛋白及其克隆方法和重组刺参bpi基因工程菌构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学以及基因工程领域，尤其是涉及一种刺参BPI基因、编码 蛋白及其克隆方法和重组刺参BPI基因工程菌构建方法。
【背景技术】
[0002]杀菌通透性增强蛋白（Bactericidal/permeability-increasing protein，BPI) 是嗜中性粒细胞（Polymorphonuclear neutrophils，PMNs)分泌的一种阳离子抗菌糖蛋白， 具有选择性杀伤革兰氏阴性细菌（gram-negative bacteria，G〇和中和内毒素等功能。BPI 作为机体自身抗菌系统的一种产物，是迄今为止唯一被认为同时具有杀菌和中和内毒素两 种功能的抗菌物质。研宄发现BPI的N端片段具有与BPI同等的功能。BPI N端富含阳离 子，能与内毒素的毒性成分类脂质A区域特异结合进而改变细菌细胞壁的通透性而杀死细 菌。随着研宄的深入，研宄者发现BPI除具有杀菌和中和内毒素外，还具有抗革兰氏阳性菌 和真菌，中和肝素，促进补体活化，以及抗血管生成和免疫调节等多种生物学功能，在机体 内被称为"超级抗生素"。
[0003]目前，对BPI生物学功能的研宄主要集中在人及其他哺乳动物，在低等脊椎动物 和无脊椎动物中的研宄相对甚少，BPI蛋白活性分析仅见于大黄鱼和牡蛎中。而此类抗菌 物质的出现，不但为临床抗感染治疗提供了新的"武器"，而且为解决日趋严重的细菌耐药 问题提供了新的思路。因此，深入研宄主要水产养殖品种免疫防御机制，利用水产养殖动物 自身抗菌物质，这样为解决海水养殖业病害预防，开展健康养殖和实现养殖业可持续发展 具有重要意义。
[0004]刺参（々70s，是属于棘皮动物门（(a)、海参纲 (//〇/〇从tfriofea)、循手目（Aspit/ocAirote)的重要经济种类，是一种高蛋白、低脂肪、低糖、 无胆固醇的重要经济养殖水产动物。但由病原菌引发的疾病严重制约了该产业的健康和持 续发展。目前在生产中大多使用抗生素和水体消毒剂防治，但抗生素的大量使用诱导致病 菌产生耐药性，导致抗生素失效，水体消毒剂往往对刺参有较大的刺激作用。因此，构建水 产动物抗菌肽基因表达工程菌，进而产业化高产量且价格低廉的生产天然抗菌药物已迫在 眉睫。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种刺参BPI基因、编码蛋白及其克隆方法和 重组刺参BPI基因工程菌构建方法，表达的重组杀菌通透性增强蛋白N末端产物对副溶血 弧菌，哈维氏弧菌，藤黄微球菌具有明显的杀菌作用。
[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为： 1、一种刺参BPI基因，该基因具有SEQIDNO. 1所示的cDNA序列。该序列全长2208bp， 包括1455bp的开放阅读框，编码484个氨基酸，5'非编码区长395bp，3'非编码区长358 bp，具有多聚腺苷酸信号，mRNA末端不稳定信号以及序列末端含有典型的polyA尾(通常 位于mRNA上的150-200个腺苷酸残基)。
[0007] 2、上述刺参BPI基因的克隆方法，根据与BPI基因同源的表达序列标签EST序列 设计RACE的巢式引物，采用RACE技术扩增基因全长，具体步骤如下： (1) 通过对腐皮综合症发病刺参和健康刺参体腔细胞高通量转录组测序和表达谱 分析，发现了多条编码BPI基因的EST序列（PengjuanZhang,ChenghuaLi,LinZhu, XiurongSu,YeLi,ChunhuaJin,TaiwuLi.DeNovoassemblyoftheseacucumber ApostichopusjaponicushemocytestranscriptometoidentifymiRNAtargets associatedwithskinulcerationsyndrome.PlosONE2013. 8(9):e73506.)，选取编 码刺参BPI部分片段的EST克隆； (2) RACE引物设计：根据编码刺参BPI部分片段的EST克隆设计RACE的巢 式引物：3'上游特异性引物1 :TTCAAAGCACAAAACAACCCGTC，3'上游特异性引物2 : TGGGTGTCATCTTITGAAGGTGT;5' 下游特异性引物 1 :GCACTGTTGATGAGGTAGTCGCT， 5'下游特异性引物2 :GTGTCCGCAGTAAGGAGTAATCT，扩增3'接头引物Adaptor3 : TACCGTCGITCCACTAGTGAITT，扩增 5' 接头引物Adaptor5:CATGGCTACATGCTGACAGCCTA; (3) RACE扩增获取刺参BPI基因全长序列，具体步骤如下： a. 总RNA提取：取刺参体腔液1. 0mL，800g离心5min，收集体腔细胞，加入Trizol 试剂(购于Takara公司）1.0mL，震荡混勾，室温放置5min，再加入0. 2mL氯仿，震荡混勾， 室温静置10min，4 °C，12000g，离心15min，吸取上清至离心管中，加入该上清等体积的 异丙醇，混勾，室温静置5min，4 °C，12000rpm，离心10min，去上清，在沉淀中加入质量百 分浓度为75%的乙醇1mL，4°C，12000rpm，离心5min，去上清，沉淀静置5-10min，加20 yL无RNA酶水，得到RNA提取液； b. 3'-RACE扩增：将上述RNA提取液用 3'_FullRACECoreSetwithPrimeScript? RTase试剂盒（Takara公司）逆转录合成扩增3'的模板，具体合成方法依试剂盒说明书操 作，以此为模板，使用3'上游特异性引物1和扩增3'接头引物进行PCR扩增，取PCR产物 1ul作为模板，再用3'上游特异性引物2和扩增3'接头引物进行PCR扩增，得到3'端目 的条带； c. 5' -RACE扩增：将上述RNA提取液用5'-FullRACEKit试剂盒（Takara公司）逆 转录合成扩增5'的模板，具体合成方法依试剂盒说明书操作，以此为模板，使用5'下游特 异性引物1和扩增5'接头引物进行PCR扩增，取PCR产物1ul作为模板，再用5'下游特 异性引物2和扩增5'接头引物进行PCR扩增得到5'端目的条带； d.将扩增产物3'端目的条带和5'端目的条带用凝胶回收试剂盒(百泰克）回收，回 收产物与载体pMD18_T(Takara公司）连接，转化至大肠杆菌co/iDH5a (Takara公司）后，在含有氨苄浓度为50ug/mL的LB平板培养基（LB平板培养基配方为胰 蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L)中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行 RCR验证并送至上海生工生物工程有限公司测序，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得到刺 参BPI基因全长序列，其基因序列如SEQIDN0. 1所示。
[0008] 上述RACE扩增反应体系及反应条件：模板1. 0 y L，10XPCR缓冲液(不含Mg2+) 2. 5 y L，浓度25 mM的MgCl22. 0 y L，浓度2. 5 mM的dNTP 2. 0 y L，浓度10 y M的特异 性引物1.0yL，浓度10yM的接头引物1.0yL，浓度5U/yL的DNA聚合酶0. 2yL，超 纯水：15.3yL;扩增条件：94°C3min、94°C30s、60°C30s、72°C1min，共 35个 循环，最后72 °C延伸10min。
[0009] 3、一种刺参BPI基因的编码蛋白，该编码蛋白具有SEQIDNO. 2所示的氨基酸序 列。该蛋白分子量为54. 323KDa，等电点为5. 58,其中编码序列的1-21位为信号肽序列， 编码序列的29-242位为N端结构域，编码序列的257-462位为C端结构域，含有两个半胱 氨酸（Cys)，形成1个分子内二硫键。
[0010] 4、一种刺参BPI基因编码蛋白的N端蛋白质，该蛋白质具有SEQIDN0. 3所不的氣 基酸序列。
[0011] 5、一种重组刺参BPI基因工程菌的构建方法，设计PCR引物，用分别含有及?"I 位点和I位点的引物扩增刺参BPI蛋白的N端结构域，即权利要求6所述的刺参BPI 基因编码蛋白的N端蛋白质；将克隆得到的目的基因插入pET28a( + )载体，获得重组质粒 pET28a( +)-BPIN;对重组质粒pET28a( + )-BPIN进行诱导表达，再进行纯化复性即获得基 因工程菌。具体步骤如下： (l)BPI蛋白质N末端结构域克隆及重组蛋白的构建与表达 a. 总RNA提取：取刺参体腔液1. 0mL，800g离心5min，收集血细胞，加入Trizol试 剂(购于Takara公司）1.0mL，震荡混勾，室温放置5min，再加入0. 2mL氯仿，震荡混勾， 室温静置10min，4 °C，12000g，离心15min，吸取上清至离心管中，加入该上清等体积的 异丙醇，混勾，室温静置5min，4 °C，12000rpm，离心10min，去上清，在沉淀中加入质量百 分浓度为75%的乙醇1mL，4°C，12000rpm，离心5min，去上清，沉淀静置5-10min，加20 yL无RNA酶水，得到RNA提取液； b. cDNA合成：将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒（Takara)逆转录合成cDNA，具体 合成方法依cDNA试剂盒说明书操作，然后以合成的cDNA为模板，用分别含有I位点和 AfotI位点的引物扩增刺参编码BPI蛋白N端结构域的基因序列(氨基酸序列如SEQIDN0. 3 所示）即如下所示： 含没h/7I位点BPI上游扩增引物：CGGGATCCCGAATCACTCCCAACGGATTTCG含AfotI位点BPI下游扩增引物：TTGCGGCCGCATGGCCAGTTGCATAAACCTCCC 。.？0?扩增：〇0嫩1.〇1^，10\?0?缓冲液(不含]\%2+)2.51^，浓度25 1111的]\%(：12 2. 0yL，浓度2. 5mM的dNTP2. 0yL，浓度10yM的上游引物含没I位点BPI上游扩 增引物1.0UL，浓度10yM的下游引物含NotI位点BPI下游扩增引物1.0yL，浓度 5U/yL的DNA聚合酶0.2yL，超纯水 15.3yL;扩增条件：94°C3min、94°C30s、60 °C30s、72°C1min，共 35 个循环，最后 72°C延伸 10min; d. PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒(百泰克）回