靶向肝癌细胞的细胞制备物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学领域，并具体涉及特异性识别肝癌细胞的细胞制备物、其制备 方法及其用途。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着基因工程技术的发展，人们将抗体对抗原的高特异性和T细胞对靶 细胞的细胞毒杀伤作用结合起来，构建了能够特异性识别抗原并活化T细胞的嵌合型抗 原受体（chimericantigenreceptor,CAR)。CAR主要包括抗原特异性抗体单链可变区 (scFv)、间隔序列（spacer)、跨膜区（TMDomain)和T细胞活化基序。根据T细胞活化基序 的组成，CAR经历了三代的变革。最初第一代CAR仅含有1个胞内的信号分子（FceRIY或 CD3 但人们用第一代CAR转染T细胞并不能有效地活化T细胞，反而引起T细胞的失能 和凋亡。T细胞的完全活化需要CD3和CD28双信号刺激，但有些肿瘤细胞不表达或低表达 共刺激分子如B7分子，人们发现在第一代CAR的基础上，在胞内区进一步加入共刺激信号 分子（CD28活化区等），可显著增强细胞因子（如IL-2、IFN-y和颗粒酶）的分泌和抗肿瘤 能力，这是第二代CAR，其中，共刺激信号分子还可以是41BB、IC0S、0X40等。在第二代CAR 的基础上，发展出第三代CAR，其胞内区包含三种信号分子。CAR修饰的T淋巴细胞可通过 scFv特异性识别肿瘤抗原或病毒，将T细胞活化信号传递到T细胞内，激活T细胞靶向杀伤 肿瘤或病毒。
[0003]CAR修饰的T细胞（CAR-T)可用于治疗相关肿瘤，通过对患者自体的T细胞的修 饰，使T细胞活化，分泌杀伤性物质，杀伤肿瘤。因此，CAR-T淋巴细胞具有很好的肿瘤靶 向性，并且无主要组织相容性复合体（MHC)的限制。此外，CAR-T是对患者自体的T细胞进 行改造，并且CAR的整个分子骨架是人源的，故能够避免机体对CAR-T细胞的排斥反应，使 CAR-T细胞在体内可长时间存活。
[0004] 目前对于肿瘤过继性细胞免疫治疗主要包括CIK细胞，DC-CIK细胞等，但由于 CIK具有广谱杀伤作用，可对自身组织造成损伤，这限制了其在临床的应用。另外，制备 DC-CIK的效率有待进一步提高，从外周血中获取CIK的数量有限，并且成本较高，大大限制 了DC-CIK的临床应用性。
[0005] HBV感染与原发性肝癌发生密切相关，据统计约70%以上的肝癌患者HBsAg阳性。 肝癌局部抗肿瘤免疫的效应细胞主要是CTL和辅助性T细胞，肝癌细胞可通过抗原递呈途 径将HBsAg降解为肽段，呈递到⑶8细胞表面，激活⑶8淋巴细胞。但由于肿瘤细胞低表达 MHC分子和共刺激分子，不能有效呈递抗原肽和活化CTL，因此，肝癌局部处于免疫低下状 态，免疫系统不能有效清除肝癌细胞。
【发明内容】
[0006] 本发明提供分离的多核苷酸，其包含编码一多肽的核苷酸序列，所述多肽包含识 别乙型肝炎病毒表面抗原的结构域、间隔区、跨膜结构域和T细胞活化结构域。
[0007] 在本发明的优选实施方式中，所述识别乙型肝炎病毒表面抗原的结构域是乙型肝 炎病毒表面抗原特异性抗体单链可变区。例如，所述单链可变区包含重链可变区、连接区和 轻链可变区。
[0008] 更加优选地，所述重链可变区包含如SEQIDN0. 47所示的氨基酸序列；连接区包 含如SEQIDN0. 49所示的氨基酸序列；轻链可变区包含如SEQIDN0. 48所示的氨基酸序 列。
[0009] 在本发明的一个【具体实施方式】中，所述间隔区包含如SEQIDN0. 50所示的氨基酸 序列。
[0010] 在本发明的优选实施方式中，所述跨膜结构域为CD28的跨膜结构域。
[0011] 在本发明的多核苷酸中，所述T细胞活化结构域包含至少一个T细胞活化基序。
[0012] 优选地，所述T细胞活化结构域包含两个T细胞活化基序。
[0013] 更优选地，所述T细胞活化结构域包含三个T细胞活化基序。
[0014] 优选地，所述T细胞活化基序选自⑶137、⑶28和⑶3G的活化基序。
[0015] 本发明还提供真核表达载体，其包含上述本发明的多核苷酸。
[0016] 本发明还提供制备包含靶向肝癌细胞的T细胞的细胞制备物的方法，其包含以下 步骤：以上述本发明的真核表达载体转化分离的外周血单个核细胞。
[0017] 在本发明的优选实施方式中，所述方法进一步包括从转化的外周血单个核细胞中 分离⑶8+T细胞。
[0018] 在本发明的进一步优选实施方式中，所述方法进一步包括体外扩增所述细胞。
[0019] 本发明还提供包含靶向肝癌细胞的T细胞的细胞制备物，其根据上述本发明的方 法而制备。
[0020] 本发明还提供靶向肝癌细胞的CD8+T细胞，所述CD8+T细胞包含上述本发明的多核 苷酸，且所述CD8+T细胞能够表达由所述多核苷酸编码的多肽。
[0021] 本发明还涉及上述本发明的细胞制备物和细胞在制备用于治疗肝癌的药物组合 物中的应用。
【附图说明】
[0022] 图1 :HBsAg特异性抗体单链可变区的克隆和MGT软件分析。
[0023] 图中A是重链可变区VH和轻链可变区VL的PCR产物的电泳结果；B是根据VH和 VL的PCR产物的测序结果翻译的氨基酸序列与已知的其它抗体的重链和轻链的氨基酸序 列进行同源性比对的结果。
[0024] 图2:编码HBsAg特异性嵌合型抗原受体的DNA的重组。
[0025] 图中A是融合的DNA的组成结构示意图，B是构建完成的DNA的电泳图。
[0026] 图3 :HBsAg特异性嵌合型抗原受体的表达和定位。
[0027] 图中A是对分离的膜蛋白进行Westernblot分析的结果；B是表达CAR-Flag融 合蛋白的293T细胞的共聚焦显微镜观察的结果。
[0028]图 4 :pLenti6. 3_MCS-IRES2_EGFP慢病毒载体图谱。
[0029]图5 :共聚焦显微镜观察HBsAg特异性嵌合型抗原受体慢病毒载体的表达和定位。
[0030] 图6 :HBsAg特异性嵌合型抗原受体慢病毒感染PBMC的效率以流式细胞仪检测的 结果。
[0031] 图7:ELISA检测HBsAg特异性嵌合型抗原受体慢病毒感染的PBMC与肝癌细胞系 共培养后，分泌IFN-Y的结果，其中纵坐标轴为细胞培养上清中IFN-Y的浓度。
[0032] 图中CAR组代表以HBsAg特异性嵌合型抗原受体慢病毒感染的PBMC，Negative组 代表未改造的慢病毒感染的PBMC。
[0033] 图8 :HBsAg特异性嵌合型抗原受体慢病毒感染的PBMC对肝癌细胞增殖的影响。
[0034] 图中E:T表示PBMC与HeP3B肝癌细胞的细胞数的比；CFSELow(%)表示CFSE低 标记的的细胞所占的比例；CAR表示HBsAg特异性嵌合型抗原受体慢病毒感染的PBMC组； Negative表示未改造的慢病毒感染的PBMC组。
[0035] 发明详述
[0036] 嵌合型抗原受体（CAR)又称人工T细胞受体、嵌合型T细胞受体、嵌合型免疫受 体，是一种人工设计的受体，可以赋予免疫效应细胞某一种特异性。普遍来讲，这一技术被 用于赋予T细胞特异性识别肿瘤表面抗原的特性。通过这种方法，可以产生大量的靶向杀 伤肿瘤细胞。
[0037]HBsAg是HBV病毒的表面抗原，靶向