84k杨组蛋白去乙酰化酶基因及其编码的氨基酸的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种杨树组蛋白去乙酰化酶基因及其编码的氨基酸。
【背景技术】
[0002] 84K杨（PopulusalbaxPopulusglandulosa)也称为银白杨X腺毛杨，树体高大挺 拔、树形优美、树干光滑，皮青灰色，叶片圆，正面深绿色，背面密被白绒毛，后逐渐脱落。84K 杨是韩国培育成功的一个著名白杨派杂种无性系，于1984年引入我国，2000年在陕西通过 林木良种审定。84K杨具备插条育苗成活率高、根系发达、生根容易、苗期与幼树生长快、材 质好、抗风能力及抗性强、适应性广、抗逆性较强等多种优良特性，不仅是优良的造林树种、 也是优美的城市绿化树种。
[0003] 虽然84K杨是雄性无性系，没有飞絮，不会污染环境，但是存在雌花飞絮的问题。 84K杨的花单性、雌雄异株，每年春夏季，雌树上的蒴果开裂后种子随处飞散，严重影响市民 的生活和工作。采用嫁接雄株、喷洒药剂等方法不仅成本高、污染环境，而且不能彻底解决 飞絮问题。
【发明内容】
[0004] 为了解决84K杨雌花飞絮的问题，本发明提供了一种与84K杨雌花发育相关的84K 杨组蛋白去乙酰化酶基因及其编码的氨基酸。
[0005] 本发明84K杨组蛋白去乙酰化酶基因的核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。
[0006] 本发明84K杨组蛋白去乙酰化酶基因编码的氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0007] 本发明84K杨组蛋白去乙酰化酶基因被命名为84K杨组蛋白去乙酰化酶基因 HDT903,84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903全长为918bp。
[0008] 本发明84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903与毛果杨组蛋白去乙酰化酶基因 HDT903的cDNA序列的同源性仅为84. 52 %。
[0009] 本发明84K杨组蛋白去乙酰化酶基因编码的氨基酸被命名为84K杨组蛋白去乙酰 化酶HDT903,属于组蛋白去乙酰化酶（HDAC)家族中HD2亚家族。84K杨组蛋白去乙酰化酶 HDT903由305个氨基酸组成，在第179~214位包含一段由36个氨基酸组成的富含酸性氨 基酸的序列。
[0010] 本发明将84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903在烟草中转化表达后，转基因烟草 花的形态和发育出现异常，多个株系出现花型和花瓣表型异常的花，如花瓣扭曲、两朵花合 用一个花萼等，说明本发明将84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903在花发育过程中具有重 要的调控作用。利用基因工程技术有目的地调控本发明将84K杨组蛋白去乙酰化酶基因 HDT903在杨树中的表达，干扰杨树雌花的正常发育，可以调节杨树的育性，为培育雌花不 育杨树新品种奠定遗传资源基础，对解决84K杨雌花飞絮的问题以及城市绿化具有重要意 义。
[0011] 组蛋白去乙酰化酶HD2基因的研宄目前主要集中在拟南芥、水稻和玉米等草本植 物，而且认为该基因与叶形态、开花时间、种子发育和成熟，以及植株胁迫反应的调控等有 关。本发明基因为木本植物84K杨的组蛋白去乙酰化酶HD2基因，尚属首次，而且该基因与 花的表型异常及败育现象有关。
【附图说明】
[0012] 图1是【具体实施方式】一中通过RT-PCR的方法检测84K杨组蛋白去乙酰化酶基因 HDT903在转基因烟草中表达量的实验结果图。图1中1号泳道为非转基因烟草（WT野生 型），2~10号泳道为84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903转基因烟草。
[0013] 图2是非转基因烟草植株花瓣的形态图。
[0014] 图3是84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903转基因烟草的异常花的形态图。
[0015] 图4是84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903转基因烟草的异常花的形态图。
[0016] 图5是84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903转基因烟草花不能结实的图片。
【具体实施方式】
[0017] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0018] 一：本实施方式84K杨组蛋白去乙酰化酶基因的核苷酸序列如SEQ IDN0 :1 所示。
[0019] 84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903按以下步骤获得：
[0020] 1、总RNA的提取：采用Trizol的方法提取84K杨叶片总RNA，具体方法参照Trizol 试剂盒说明书（Invitrogen)进行；
[0021] 2、cDNA的合成：采用PrimeScriptRTreagentKit(TaKaRa)试剂盒将所提取的 总RNA反转录成cDNA，具体方法参照该试剂盒说明书进行；
[0022] 3、PCR扩增：以84K杨cDNA为模板，采用PCR扩增的方法获得84K杨组蛋白去乙 酰化酶基因HDT903DNA片段，所用引物为：
[0023]Forward(SEQIDN0:3) :5? -GCTCTAGAATGGAGTTCTGGGGTGTTGA-3,,
[0024]Reverse(SEQIDNO:4): 5 ' -GGGGTACCCTATGCAGCACTGTGCTTAG-3 '〇
[0025] 在cDNA的5'和3'端分别加入了Xbal和Kpnl酶切位点；
[0026]PCR反应体系为 20yL，由 2yL10XLAPCRbuffer、3. 2yL浓度各为 2. 5ymol/ 1的(1阶1\0.41^浓度为10 11111〇1/1的上游引物？〇,31(1(5￡0 10勵:3)、0.41^浓度为 10ymol/L的下游引物Reverse(SEQIDN0:4)、0.2yLLATaq酶、lyLcDNA模板和12.8yL ddH20组成；
[0027]PCR反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30S、58°C退火复性30s、72°C延伸 60s、30个循环，72°C延伸10min，即得到84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903。
[0028] 将得到的84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903PCR产物在0.8%的琼脂糖凝 胶上电泳检测，切取特异条带，纯化回收后（试剂盒为Omega产品）连接到pMD19-T载体 (TaKaRa)上，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞（北京博迈德基因技术有限公司），蓝白斑筛 选，选取阳性单菌落于LB液体培养中培养，菌液PCR检测确认，测序工作由北京六合华大基 因科技股份有限公司完成；确定84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，进而可得到其编码的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0029] 将84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903的DNA片段用内切酶Xbal和Kpnl从 PMD19-T载体上酶切下来，纯化回收后（试剂盒为Omega产品）连接到植物表达载体pROKII 的位于花椰菜花叶病毒（CaMV) 355启动子和胭脂碱合成酶（nos)终止子之间的多克隆位点 (84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903两端含有Xbal和Kpnl酶切位点），将连接产物转化 大肠杆菌DH5a感受态细胞（北京博迈德基因技术有限公司），选取单菌落于LB液体培养 中培养，提取重组质粒（试剂盒为Omega产品）后用Xbal和Kpnl双酶切检测确定，得到重 组表达载体PR0KII-84K-HDT903。将pR0KII-84K-HDT903重组表达载体通过冻融法转入根 癌农杆菌株系EHA105中，选取单菌落于LB液体培养中培养，菌液PCR检测确定。
[0030] 通过农杆菌介导的叶盘转化法将84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903转化到烟 草中，在25°C黑暗培养条件下共培养3d后，在含有50mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选抗 性芽，抗性芽在含有50mg/L卡那霉素的生根培养基上再生出根，即获得转基因植株。
[0031] 通过RT-PCR的方法检测84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903在转基因烟草中 的表达量。采用Trizol(购自Invitrogen公司）的方法提取转基因烟草叶片总RNA，并利 用PrimeScriptRTreagentKit试剂盒（购自TaKaRa公司）将所提取的总RNA反转录成 cDNA。利用上游引物Forward(SEQIDN0:3)和下游引物Reverse(SEQIDN0:4)进行PCR 检测HDT903基因的表达量，并利用上游引物18S-L和下游引物18S-R扩增18S基因作为内 参，18S-L和18S-R引物序列分别为：
[0032] 18S-L:5 ' -TCAACTTTCGATGGTAGGATAGTG-3 '，
[0033] 18S-R:5, -CCGTGTCAGGATTGGGTAATTT-3'。
[0034] PCR反应体系为20yL，由2yL 10XLAPCRbuffer、3. 2yL浓度各为2. 5ymol/ L的dNTP、0.4yL浓度为10ymol/L的上游引物、0.4yL浓度为10ymol/L的下游引物、 0? 2 y L LA Taq酶、1 y LcDNA模板和12. 8 y L ddH20组成。
[0035]PCR反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s、58°C退火复性30s、72°C延伸 30s、25个循环，72°C延伸10min。PCR反应结果显示转基因烟草中84K杨组蛋白去乙酰化酶 基因HDT903的表达量明显增加（如图1所示）。
[0036] 84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903转基因烟草植株种在直径15cm塑料钵中，塑 料钵中培养基质为草炭土：蛭石：珍珠岩=4:1:1 ;在23~25°C、16h光照/8h黑暗的条件 下培养；每3d饶水1次，每月饶1次1/4MS液体培养基。对转基因植株的生长和发育进行 观察，转基因烟草花的发育受到明显影响，多个株系出现花型和花瓣表型异常的花，如花瓣 扭曲、两朵花合用一个花萼，及败育现象一一不能结实（如图3~5所示）。
[0037] 经序列同源性比对，84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903与毛果杨组蛋白去乙酰 化酶基因HDT903的cDNA序列的同源性仅为84. 52%。与毛果杨组蛋白去乙酰化酶基因 HDT903的cDNA序列不同，84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903序列的第537~644bp处 多一段长度为l〇8bp的序列，编码36个氨基酸残基的富含酸性氨基酸的氨基酸序列。
【具体实施方式】 [0038] 二：本实施方式84K杨组蛋白去乙酰化酶基因编码的氨基酸序列如 SEQIDN0 :2 所示。
[0039] 本实施方式84K杨组蛋白去乙酰化酶基因编码的氨基酸被命名为84K杨组蛋白去 乙酰化酶HDT903。84K杨组蛋白去乙酰化酶HDT903由305个氨基酸组成，在第179~214 位包含一段由36个氨基酸组成的富含酸性氨基酸的序列。
【主权项】
1. 84K杨组蛋白去乙酰化酶基因，其特征在于84K杨组蛋白去乙酰化酶基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO :1所示。 2. 84K杨组蛋白去乙酰化酶基因编码的氨基酸，其特征在于84K杨组蛋白去乙酰化酶 基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
【专利摘要】84K杨组蛋白去乙酰化酶基因及其编码的氨基酸，它涉及一种杨树组蛋白去乙酰化酶基因及其编码的氨基酸。为了解决84K杨雌花飞絮的问题，本发明提供了一种与84K杨雌花发育相关的84K杨组蛋白去乙酰化酶基因及其编码的氨基酸。84K杨组蛋白去乙酰化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。84K杨组蛋白去乙酰化酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明将84K杨组蛋白去乙酰化酶基因HDT903在花发育过程中具有重要的调控作用。
【IPC分类】C12N9-80, C12N15-55
【公开号】CN104745611
【申请号】CN201510158463
【发明人】马旭俊, 马兴红, 刘超, 李开隆
【申请人】东北林业大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月6日