一种肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的 节杆菌及其构建方法与应用。
【背景技术】
[0002] 微生物育种是以提高微生物菌株生产性能为目标，人为改造微生物菌株的遗传性 能的过程。主要是通过阻断代谢支路或者增强目标基因的表达来实现，对于代谢途径的阻 断，传统的方法是通过诱变，筛选缺陷型突变株，该方法工作量大、筛选过程繁琐，并且存在 回复突变率高、菌株发酵性能不稳定的缺点。随着现代生物学的发展，通过分子生物学的手 段从基因组上进行定点敲除成为了最佳选择。基因敲除又分为多种方法，其中以同源重组 法最为成熟。在
[0003] 生物细胞中，DNA或RNA分子间或分子内的同源序列能在自然条件下以一定的频 率发生重新组合，这个过程称为同源重组（HomologousRecombination)。同源重组的频率 与DNA或RNA序列的同源程度（即序列的相似程度）、同源区域大小以及生物个体的遗传特 性密切相关，一般而言，同源程度越高、同源区域越大，重组的频率就越高。为了快速、高效 的筛选到目的基因敲除的重组子，需要尽可能延长敲除质粒的同源臂。然而常规的构建方 法是通过聚合酶链式反应来获得同源臂，受到DNA聚合酶保真度和测序长度的限制，无法 获得太长的同源臂，目前普遍应用的同源臂的长度约为50~5000bp。但是由于微生物基因 比较复杂，即使同源臂的长度为2000~5000,发生重组的概率仍然很低。因此需要寻找一 种获得较长同源臂的方法，提高同源重组的效率。
[0004]cAMP作为细胞内的第二信使，其生物合成受到严格的代谢调控。为使其过量积累， 只有运用代谢工程的手段，去除代谢通路中不必要的分支途径，促使碳流流向目的产物积 累的方向；或者切除产物的分解途径，避免发酵过程中产物的降解。IMP是嘌呤类核苷酸合 成途径中的代谢节点，起到重要的流量分配作用。选育肌苷酸脱氢酶（EC1. 1. 1. 205,简称 MPDH)缺失的突变株，可以阻断MP到XMP的支路代谢，避免进入GMP循环造成的代谢流 浪费，保证代谢流向AMP循环的方向进行。而且从代谢途径上分析，頂PDH缺失还能够解除 GMP、XMP对PRPP转酰胺酶的反馈抑制，进一步加强嘌呤核苷从头合成途径的通量。作为节 杆菌生长代谢的重要基因，利用普通的同源重组的方法很难将肌苷酸脱氢酶基因敲除，因 此，需要寻找一种能够高效敲除该基因的方法，同时，不引入抗性基因、能稳定遗传的肌苷 酸脱氢酶缺陷型菌株。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是，提供一种遗传稳定肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆 菌。
[0006]本发明还要解决的技术问题是，提供一种利用大片段同源重组质粒敲除节杆菌肌 苷酸脱氢酶基因的方法。
[0007] 本发明最后要解决的技术问题是，提供上述肌苷酸脱氢酶基因缺陷型节杆菌在发 酵产cAMP中的应用。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0009] 一种肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌的构建方法，该方法包括如下步骤：
[0010] (1)大片段获取：提取节杆菌基因组DNA，用限制性内切酶Hindlll酶切该基因组 DNA，回收酶切得到的DNA片段；
[0011] ⑵同源线性化载体扩增：以PARK质粒为模板，SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示 的序列为引物，扩增得到线性化载体；
[0012] (3)利用Rec-ET系统连接线性化载体与大片段：制备大肠杆菌Gbdir感受态，将 步骤（1)得到的DNA片段和步骤（2)得到的线性化载体同时转化大肠杆菌Gbdir感受态细 胞，涂布卡那霉素抗性平板，得到的阳性克隆中含有pUK-gMP重组质粒；
[0013] (4)PCR-targeting替换目的基因：将pUK-gMP重组质粒转化大肠杆菌BW25113/ PIJ790感受态细胞，再将含有pUK-gMP重组质粒的大肠杆菌BW25113/pIJ790进一步制备 成感受态；
[0014] 以口11773质粒为模板，5￡〇10勵.3和5￡〇10勵.4所示的序列为引物，扩增 安普霉素抗性基因，并回收PCR得到的片段，将该安普抗性基因片段电转化含有pUK-gMP 重组质粒的大肠杆菌BW25113/pIJ790感受态细胞，涂布含有卡那霉素和安普霉素双重 抗性的平板，得到的阳性克隆中含有impdh基因部分被安普抗性霉素抗性基因替换的 pUK-gMP-AP质粒；
[0015] (5)删除插入片段：用Spel酶切pUK-gMP-AP质粒，去除安普抗性基因，回收大片 段后，自连环化，转化大肠杆菌DH5a感受态，得到的阳性克隆中含有pUK-dMP质粒；
[0016](6)双交换重组子筛选：将pUK-dMP质粒电转化节杆菌，涂布含有卡那霉素抗性 的平板，对得到的阳性转化子进行松弛实验，直到筛选得到发生双交换的重组子，该发生双 交换的重组子即肌苷酸脱氢酶基因缺陷型节杆菌。
[0017] 步骤（6)中，所述的节杆菌的保藏号为CGMCC NO. 3584。
[0018] 步骤（6)中，所述的松弛实验按照如下方法进行：
[0019] 将步骤（6)所述的阳性转化子，挑至不含卡那霉素的LB液体培养基中，培养至菌 液浑浊，划线至不含卡那霉素的LB平板培养基，分出单菌落，双挑至含有卡那霉素抗性平 板和不含卡那霉素的LB平板培养基，观察转化子生长情况；
[0020] 若抗性平板上生长的菌体，应当是发生单交换的转化子，保留了载体上的卡那抗 性基因，若发生双交换，则载体上的卡那抗性基因会丢失，因此只能在无抗性平板上生长；
[0021] 如没有符合要求的转化子出现，则重新将不含卡那霉素的LB平板培养基上的转 化子，挑至不含抗性的LB液体培养基，进行第二轮松弛，直至筛选到在卡那霉素抗性平板 上不长，在无抗性平板上生长的节杆菌转化子。
[0022] 上述肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌的构建方法得到的肌苷酸脱氢酶基因缺 陷型节杆菌在本发明的保护范围之内。
[0023] 上述肌苷酸脱氢酶基因缺陷型节杆菌在制备cAMP中的应用，包括如下步骤：
[0024] (la)将肌苷酸脱氢酶基因缺陷型节杆菌先在节杆菌培养基上划线活化，再挑单菌 落于液体培养基中，培养19~24h;
[0025] (2a)将液体培养基中的肌苷酸脱氢酶基因缺陷型节杆菌转接到发酵培养基中，在 发酵罐中，发酵产cAMP。
[0026] 其中，步骤（la)所述的节杆菌培养基的组成为：葡萄糖1~15g/L，蛋白胨1~ 20g/L，酵母膏5~20g/L，牛肉膏10g/L，pH7. 2,溶剂为水；
[0027] 其中，步骤（2a)所述的发酵培养基的组成为：葡萄糖30~60g/L，K2HP04 15~ 25g/L，KH2P04 1 ~10g/L，MgS04 ? 7H20 0? 1 ~0? 5g/L，尿素 10 ~15g/L，CoCl2 0? 01 ~ 0? 02g/L，NaFO. 1 ~lg/L，生物素 0? 01 ~0? 05g/L，次黄嘌呤 5 ~10g/L，黄嘌呤 0? 1 ~0? 2g/ L，pH7.0,溶剂为水。
[0028] 步骤（2a)中，发酵过程中，发酵罐的搅拌转速250~400rpm，优选350rpm。
[0029] 步骤（2a)中，发酵过程中，发酵罐的通气量为5~15L/min，优选8L/min。
[0030] 制备大肠杆菌Gbdir感受态：37°C平板活化；挑单菌落至5mLLB培养基，37°C过 夜（〇D6QQ约为3-4);转接40yL至1. 4mLLB培养基，37°C培养2h左右，至OD6QQ约为0?4 ; 加入阿拉伯糖至终浓度为2. 5mg/mL，37°C诱导45min;4°C，9500Xg离心30s，收集菌体；弃 上清，加入lmL冰冷的无菌水，洗绦菌体；重复一次；用30yL冰冷的无菌水重悬菌体，作为 电转感受态。
[0031] 向Gbdir电转感受态中加入0. 5yg线性化载体和约5yg基因组酶切回收片段， 1350V(lmm)，电击；立即加入lmLLB，37°C复苏70min;离心，涂50yg/mL卡那平板；菌落 PCR，检验是否含有目的基因，阳性克隆命名为pUK-gMP。
[0032] 大肠杆菌Gbdir在阿拉伯糖的诱导下，能够表达来自Rac菌体的RecE、RecT重 组酶和来自A噬菌体的Red丫重组酶，可以使两个具有50bp同源臂的线性化片段发生同 源重组，称为LLHR(Linear_LinearHomologousRecombination)。将基因组DNA酶切回收 片段与线性化载体混合，电转Gbdir感受态，根据线性化载体上的卡那霉素抗性基因筛选 发生重组的转化子。
[0033] 含有pUK-gMP重组质粒的大肠杆菌BW25113/pIJ790感受态制备：30°C平板活化； 挑单菌落至5mLLB培养基（含氯霉素25yg/mL、卡那霉素50yg/mL)，30°C过夜（0D_约为 3-4);转接100yL至10mLLB培养基（含1