一种促进谷氨酸棒状杆菌生长的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种促进谷氨酸棒状杆菌生长的方法，属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002] 腺昔单憐酸核昔酶（adenosinemonophosphatenucleosidase)在调节腺昔酸库 中发挥着非常重要作用。当胞内ATP过量时，它催化AMP分解生成腺嘌呤和5-磷酸核糖， 导致AMP向ADP的合成量减少，进而降低了腺苷酸库中ATP的含量；当胞内ATP不足时，腺 苷单磷酸核苷酶的活性受到抑制，减少了AMP的降解，从而促进了ATP的合成。早期，关于 编码腺苷单磷酸核苷酶的基因amn的研宄主要集中在该基因所编码酶的结构上，近年来， 对于该基因的研宄开始转向生理代谢方面。
[0003] 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacteriumglutamicum)是一种兼性好氧的革兰氏阳性 菌。自1957年被分离出来以后，它便逐渐成为全世界范围内氨基酸生产的主要菌株。目前 促进谷氨酸棒状杆菌生长的方法主要是优化菌体生长条件，或者通过高密度发酵获得大量 菌体。本发明鉴定出一种与谷氨酸棒状杆菌能量代谢相关的基因amn，敲除该基因能在同等 条件下获得更多的菌体。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种促进谷氨酸棒状杆菌生长的方法，是敲除基因amn，基因amn的 核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0005] 敲除谷氨酸棒状杆菌的能量代谢相关基因amn，获得缺失amn基因的突变菌株 Aamn，发酵过程中突变菌株的细胞干重提高。
[0006] 本发明还提供了一种生长能力增强的谷氨酸棒状杆菌，其基因组上amn基因发生 缺失突变。所述生长能力增强的谷氨酸棒状杆菌的获得，可通过同源重组技术敲除基因组 上amn基因。
[0007] 本发明确认了参与谷氨酸棒状杆菌能量代谢的基因amn，其功能是在细胞生长中 发挥重要作用，敲除该基因，胞内ATP水平得到提高，碳源更多用于菌体生长，最终提高生 物量。与野生菌株WT相比，基因amn缺失菌株细胞干重提高了 16. 2%，发酵10h、25h和40h 的胞内ATP分别提高了 3. 0、3. 7和2. 2倍。amn基因的缺失提高了菌株的胞内ATP水平和 生物量。
【附图说明】
[0008] 图1基因amn缺失菌株的构建及验证，其中M:DL10000DNAmarker;1 :WT菌株基因 组PCR;2 :突变菌株Aamn基因组PCR
[0009] 图2谷氨酸发酵过程中胞内ATP水平
【具体实施方式】
[0010] 谷氨酸发酵条件及参数测定：通过测定谷氨酸发酵过程中的生物量和谷氨酸产量 对发酵过程进行评价。
[0011] (1)种子培养条件：从新鲜斜面上接一环菌接种到种子培养基（50ml/500ml锥形 瓶），32 °C、200r/min培养 8h~9h。
[0012] (2)发酵培养条件：7. 5L发酵罐的装液量为3L，接种量为8%，温度32°C，通过自 动流加30 %的氨水和稀硫酸将pH控制在7. 2~7. 3,通气量lvvm，通过与转速相连将溶氧 控制在20 %左右，根据泡沫情况添加消泡剂。
[0013] (3)菌体浓度的测定：将发酵液稀释一定的倍数，在波长620nm处测定吸光值，菌 体干重为〇D62Q数值的0. 25倍。
[0014] (4)谷氨酸和葡萄糖浓度的测定：将样品稀释特定的倍数，利用SBA-40型生物传 感器测定。
[0015] 胞内ATP水平测定：取20mL不同时间点的发酵液，离心去上清，迅速置于液氮中保 持3min，用液氮研磨破碎细胞，加入预冷的PBS溶液，用HPLC法测定ATP含量。色谱条件 为：AgilentZORBAXSB-Aq反相柱，检测波长UV254nm，柱温35°C，进样量10yL，流速lmL/ min，流动相为磷酸盐缓冲液（10.93gNaH2P04,3 . 04gNa2HP04,3. 22g四正丁基溴化铵，超纯 水定容至1L):乙腈=86:14。
[0016] 实施例1
[0017] 以提取的CorynebacteriumglutamicumS9114的基因组为模板，分别扩增 amn基因上游和下游长度约为800bp的基因片段，利用重叠延伸PCR，获得amn基因内 部缺失809bp的敲除框片段amn-LR;然后利用限制性内切酶HindIII和SmaI对质粒 PK18m〇bSacB进行双酶切，形成具有粘性末端的线性片段；最后，利用T4DNAligase连接敲 除框amn-LR和酶切后的pK18mobSacB载体，形成敲除质粒pK18mobSacB/amn_LR。将敲除质 粒pK18mobSacB/amn_LR电转到C.glutamicum感受态细胞中后，会发生两次同源重组，将重 组菌株涂布在含有卡那霉素抗性的LBHIS平板和含10%蔗糖的LBHIS平板进行两轮筛选。 能在卡那霉素抗性平板上生长而但不能在含10%蔗糖的平板上生长的单菌落认定为阳性 转化子。进一步以转化子的基因组为模板，用验证引物amn-L-pK18-S/amn-R-pK18-A进行 PCR验证，结果如图1所示。构建完成的amn基因敲除菌株命名为Aamn。
[0018] 表1突变菌株Aamn构建过程中所使用的引物
【主权项】
1. 一种促进谷氨酸棒状杆菌生长的方法，其特征在于，敲除谷氨酸棒状杆菌的基因 amn〇
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因amn的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. -种生长能力增强的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，其基因组上amn基因发生缺失 突变。
4. 根据权利要求3所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，amn基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
5. -种构建权利要求3或4所述谷氨酸棒状杆菌的方法，其特征在于，通过同源重组技 术敲除基因组上的amn基因。
6. 权利要求3或4所述谷氨酸棒状杆菌的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种促进谷氨酸棒状杆菌生长的方法，属于生物工程领域。本发明通过改造谷氨酸棒状杆菌构建了amn基因缺失菌株△amn，与野生菌株WT相比，基因amn缺失菌株细胞干重提高了16.2％，发酵10h、25h和40h的胞内ATP分别提高了3.0、3.7和2.2倍。amn基因的缺失提高了菌株的胞内ATP水平和生物量。
【IPC分类】C12R1-15, C12N1-15, C12N15-56, C12N15-77
【公开号】CN104745617
【申请号】CN201510179726
【发明人】刘立明, 梅婕, 陈坚
【申请人】江南大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月15日