蚕豆vfpp1c基因的植物表达载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种蚕豆的基因的植物表达载体及其在提高植物甲醛吸收能力中的应用，属于植物分子基因工程领域。
【背景技术】
[0002]甲醛被广泛用于工业生产中，是胶粘剂工业应用最广泛的化学原材料。随着经济的发展和人民生活水平的提高，各种原料制成的建筑装饰材料已走入各种室内公共场所和家庭，使甲醛成为室内空气污染公认最具代表性的化学物质。对新装修住宅的调查结果表明室内空气中污染的甲醛浓度是室外空气的6.65倍，在门窗关闭时甲醛浓度超标100倍。甲醛具有活泼的化学性质和生物学活性，能与蛋白质、核酸和脂类产生非特异性反应，使它们丧失生物功能，长期接触低剂量甲醛可引起多种疾病。
[0003]存在于板材内部的甲醛挥发期可长到3-15年，因此甲醛释放是一个长期的过程，彻底治理室内空气中甲醛的污染是个艰巨的任务。国内外学者对室内甲醛污染的治理进行了广泛的研宄，开发了很多治理甲醛污染的方法。在众多的净化方法中，生物净化法中的植物净化法以其简单、自然、经济、彻底等特点，受到越来越多的关注。植物能净化气体甲醛污染是因为植物能将吸收的甲醛代谢为无毒的产物，植物吸收和代谢甲醛的能力越强，净化作用就越大。然而，由于甲醛对所有的生物都有毒性，所以用植物净化甲醛时环境中的甲醛也会对植物体本身产生胁迫，从而影响植物的生理生化特性，因此植物对甲醛的吸收和净化能力还与植物对甲醛胁迫的反应有很大关系。
[0004]近年来，研宄人员通过在植物中过量表达甲醛代谢相关基因来提供植物吸收和代谢甲醛能力，并且取得了良好的效果。研宄表明在拟南芥中过量表达其内源性FALDH、黄金HEpipremnum atfrew?)和水稻FALDH均能提高转基因拟南芥对HCHO的脱毒和吸收能力，其中转黄金葛FALDH基因的效果最好；在烟草中过量表达来自短芽胞杆菌(
brevis-) VKLm增加转基因烟草氧化HCHO为HCOOH的能力，转基因烟草吸收HCHO的能力也强于WT烟草；在拟南芥、烟草的叶绿体中过量表达甲基营养菌的HCHO固定途径关键酶
6-磷酸己酮糖合成酶(HPS)和6-磷酸果糖异构酶(PHI )，利用HPS/PHI在卡尔文循环途径上构建一条HCHO光合同化途径，使转基因植物同化和吸收HCHO的能力显著增强；在野生型天竺襄i Pelargonium sp.Frensham，WT)的叶绿体中过量表达HPS-PHI融合蛋白证实这个策略在转基因天竺葵中也起作用；在烟草叶绿体中过量表达来自甲基营养型酵母HCHO同化途径(XuMP)的关键酶二羟基丙酮激酶(DAS)和二羟基丙酮合酶(DAK)，在转基因烟草叶绿体中构建另一种HCHO光合同化途径(DAS/DAK途径)，结果也提高了转基因烟草同化HCHO和修复HCHO污染的能力。这些结果说明利用基因工程手段能够有效地提高植物的甲醛吸收能力。
[0005]丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶I(PPl)是由一个固定不变的催化亚基和几十种不同的调节亚基组成的异二聚体全酶。PPl催化亚基(PPlc)的一级结构包含有约330个氨基酸残基。拟南芥/λΓ5.77(ΡΡ1 regulatory subunit2_like protein)突变抑制蓝光诱导的气孔开放、氢泵活性及质膜H+-ATPase的磷酸化，但不影响PHOT的活性和FC调控的质膜H+-ATPase活性。PPlc的选择性抑制剂Tautomycin抑制photl和phot2单突变体气孔的蓝光反应，说明PPlc介导蓝光信号向H+-ATPase传递。Takemiya等(2013)的研宄从蚕豆保卫细胞中克隆了四种编码PPl催化亚基(PPl)的cDNA，利用突变体及药理学试验证实，PPlc在蚕豆保卫细胞蓝光信号途径中，在向光素下游和质膜H+-ATPase上游之间起正调控作用，催化质膜H+-ATPase的磷酸化反应。然而目前有关PPlc是否参与甲醛胁迫应答的研宄未见报道。本发明是通过Gateway的技术构建植物表达载体PK_35S_为研宄蚕豆基因在植物应答甲醛胁迫的作用提供了有效的分子基因工程技术，有助于利用分子生物学的手段研宄蚕豆基因的功能以及通过该载体转染野生型烟草所获得的转基因的烟草在提供植物吸收甲醛能力的应用，为利用基因工程的方法提供植物吸收甲醛能力奠定了理论基础。同时，本发明中所获得的结果能够为我们通过基因工程手段提高植物吸收甲醛能力提供了更多的基因资源。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种蚕豆(Vicia faba.V) VFPPltM因的植物表达载体PK-35S-该载体是通过Gateway技术构建而成的，该载体中含有35S组成型启动子和因，因来源于蚕豆，其GenBank登陆号为AB038648。
[0007]该载体中的基因在35S组成型启动子的控制下表达，通过农杆菌介导的叶盘转化法将该植物表达载体转入野生型烟草后，外源基因在35S组成型启动子的控制下能够准确高效地表达，同时获得的转基因烟草吸收甲醛的能力也显著地提高。为了实现本发明的目的，本发明提供如下的技术方法:
1、外源基因的获得
根据GenBank上发表的蚕豆基因全长序列，其⑶S序列如序列表所示，设计如下特异性引物:
h游引物:5’ -GGATCCATGAGTGCACAAGGACAAC-3’ (含有 BamH I 酶切位点) VFPPlC^游引物:5 ’ - CTCGAGTCACATCTTGTTTGACATCAC-3 ’(含有 XhoI 酶切位点)
2、植物表达载体PK-35S-的构建
Gateway (通路克隆)技术的LR反应构建目的基因的表达载体时，通过重组过程将外源基因连入植物表达载体PK2GW7.0中，不需要经过复杂的限制内酶切的酶切和连接酶的连接过程，只需要把入门克隆载体和目的载体的质粒DNA混合并加入DNA整合或切离所需要的酶就能够完成目的基因表达载体的构建，因此用Gateway技术构建目的基因的植物表达载体，构建策略如图2所示，以蚕豆cDNA为模板，用基因的特异性引物，通过RT-PCR的方法扩增获得VFPPlC基因的⑶S序列。然后通过Τ/Α克隆获得pMD18T_ VFPPI C，对获得的阳性克隆进行测序检测外源基因是否发生突变，再经过BamHI和XhoI双酶切pMD18T- VFPPim pENTR载体，将因片段亚克隆到pENTR载体上，形成入门克隆载体pENTR- VFPP 1C,最后，在LR Mix Enzyme的作用下，入门克隆载体pENTR- VFPP1CM植物表达载体PK2GW7.0进行LR反应，形成植物表达载体简称PK-35S- VFPPI C。
[0008]3、植物表达载体PK-35S- 转化农杆菌及转基因烟草筛选
通过电转化法将植物表达载体PK-35S-K/^°7i转入农杆菌pMP105菌中，经壮观霉素(Spe)筛选得到阳性克隆，经菌液PCR检测阳性克隆中是否含有外源植物表达载体PK-35S-粒，然后通过农杆菌介导的叶盘转化法转染野生型烟草，将转染后的叶片在含有筛选因子Km(卡那霉素)和Cef (头孢噻肟钠)的芽诱导固体培养基MS4上诱导外植体发芽，约I个月继代一次，待有芽生成后，将芽从外植体上切下转入含有Km和Cef的生根培养基MS上，进行诱导生根，得到的能够抗Km的烟草幼苗还需要在基因和蛋白水平上检测外源基因是否正确表达。
[0009]4、转基因烟草的检测
经Km筛选得到的能够抗Km的烟草植株，用CTAB法提取其基因组，分别以野生型烟草和转基因烟草基因组为模板，用外源基因特异性引物，经过PCR分析检测外源基因是否整合到野生型烟草基因组中。用TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取野生型和转基因烟草的RNA，再反转录为cDNA，以cDNA为模板，用因特异性引物经RT-PCR法检测外源基因C1是否能够正确转录；最后，通过Western blot法在蛋白水平上分析外源基因在烟草中的表达情况。
[0010]5、转基因甲醛吸收能力的分析
由于我们的研宄结果发现甲醛胁迫能够抑制蚕豆的表达，因此我们在野生型烟草中过量表达来