I酶切位点。
[0115] 设计引物序列如下
[0116]Posterix-F(如SEQIDNO. 17 所示）：
[0117] AGCACGCGTCCTCAGTCCTGCTTGCCTTA
[0118]Posterix-R(如SEQIDNO. 18 所示）
[0119]GCTGCTAGCAGAGAACCGAGGAGCCAGT：
[0120] PCR反应体系：pfu酶（康为世纪）25yl，上游引物Posterix-F(10uM)2.5yl，下 游引物P〇sterix-R(10uM)2. 5y1，小鼠基因组DNA100ng，加水至 50y1。
[0121] PCR反应条件：预变性94°C5min，变性94°C30秒，退火55°C30秒，延伸72°C30 秒，重复30个循环，终延伸72°C3分。
[0122] 胶回收回收2000bp左右的条带，使用MluI内切酶（NEB)和NheI内切酶（NEB) 酶切片段，胶回收试剂盒回收片段九。
[0123]Osterix启动子序列：如SEQIDNO. 19 所示。
[0124] 2、使用MluI内切酶和NheI内切酶酶切CMV-Cas9-gRNAl-gRNA2质粒，胶回收试 剂盒回收l〇〇〇〇bp左右的片段十。
[0125] 3、将片段九和片段十按照摩尔比1 :10的比例混合用T4连接酶连接。具体操作步 骤参考试剂盒说明书。将连接产物转化DH5a大肠杆菌（康为世纪），在含有AMP(100yg/ ml)的平板尚均匀涂布，12小时后PCR筛选阳性克隆菌，挑取克隆，37°C摇菌16小时，抽提 质粒。
[0126] 4、测序证实0SX-Cas9-gRNAl-gRNA2质粒序列正确。质粒图谱信息见附图7。
[0127]七、验证0SX-Cas9-gRNAl_gRNA2活性
[0128] 1、将 0SX-Cas9-gRNAl-gRNA2 转染到MC3T3-E1 中，24 小时加入 1000ng/ml浓度的 G418筛选，72小时后收集剩余的活细胞，提取基因组DNA。
[0129] 2、使用GGCX-F和GGCX-R引物PCR扩增包含靶点的片段，将PCR产物回收，连接到 pMd-20T载体中，涂布在含有AMP(100yg/ml)，X-gal(20mg/ml)，ITPG(lmM)琼脂糖平板上 培养16小时，挑取20个白色克隆摇菌。37°C摇菌16小时，抽提质粒。
[0130] 3、质粒送公司测序，测序结果显示靶点位置DNA发生剪切。详细信息见附图8。
[0131] 构建条件性基因敲除小鼠
[0132] 1、线性化OSX-Cas9-gRNAl_gRNA2
[0133] 使用BglI单酶切OSX-Cas9-gRNAl-gRNA2,酶切后胶回收片段^^一。酶切鉴定图 见附图9。
[0134] DNA显微注射构建转基因小鼠
[0135] 线性化的OSX-Cas9-gRNAl-gRNA2质粒由中国医学科学院医学实验动物研宄所研 宄所通过DNA显微注射受精卵的方法获得转入OSX-Cas9-gRNAl-gRNA2的4只转基因小鼠。
[0136] 转基因小鼠验证
[0137] 无菌条件下剪取4只转基因小鼠后肢脚趾，将皮肤和趾骨分离干净，分别提取皮 肤和趾骨基因组DNA，PCR扩增Cas9基因和gRNA基因。
[0138] 设计引物如下
[0139] Cas9jc_F(如SEQIDNO. 20 所示）：
[0140] 5'-AGGCTGACTTGCGGTTGA-3'
[0141] Cas9jc-R(如SEQIDNO. 21 所示）：
[0142] 5'-CCGAGTGACAGGGCGATA-3'
[0143]gRNAjc-F(如SEQIDNO. 22 所示）：
[0144] 5'-AGGCTAGTCCGTTATCAA-3'
[0145]gRNAjc-R(如SEQIDNO. 23 所示）：
[0146] 5'-TGTACAAGAAAGCTGGGT-3'
[0147] PCR反应体系：ESTaqmaterMix10y1，Cas9jc-F引物 1y1，Cas9jc-R引物 1y1 (或gRNAjc-F引物1y1，gRNAjc-R引物1y1)，趾骨基因组DNA模板100ng，dH20补至 20yl〇
[0148]PCR反应条件：预变形94°C5分，变形94°C30秒，退火55°C30秒，延伸72°C1分， 35个循环，终延伸72°C5分。
[0149] 电泳图可见四只转基因阳性小鼠都检测到条带，两只阴性对照组则没有，结果表 明0SX-Cas9-gRNAl-gRNA2转基因小鼠构建成功。详细信息见附图10。
[0150] 4、条件性基因敲除小鼠验证
[0151]PCR分别扩增转基因小鼠皮肤和趾骨基因组DNA的GGCX靶点片段，具体方法参照 上述实验过程，检测到4只转基因小鼠趾骨基因组DNA能扩增出900bp大小条带，同时在 500bp左右也出现条带，而阴性对照组和皮肤中没有检测到500bp左右的条带。详细信息附 图11。
[0152] 将Founder3小鼠趾骨PCR产物回收后，连接到pMD-20-T载体中，涂布在含有 AMP(100yg/ml)，X-gal(20mg/ml)，ITPG(lmM)琼脂糖平板上培养16小时，挑取至少10个 白色克隆摇菌。37°C摇菌16小时，抽提质粒。将质粒送公司测序，测序结果显示靶点位置 DNA发生剪切。详细信息见附图12。
[0153]通过转基因技术构建条件性敲除质粒0SX-Cas9-gRNAl-gRNA2转基因小鼠，在转 基因小鼠骨中检测到特定靶点发生缺失突变，而皮肤中没有发生。单克隆测序结果确认了 特定靶点DNA发生缺失突变，由此证明利用CRISPR/Cas9技术快速构建条件性基因敲除动 物模型成功实现。这种方法构建的小鼠生长状态和繁殖能力没有受到影响。
[0154] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技 术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和 变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
[0155]
【主权项】
1. 一种条件性基因敲除动物模型的快速构建方法，其特征在于：采用CRISPR/Cas9技 术。
2. 根据权利要求1所述的快速构建方法，其特征在于：设计CRISPR/Cas9系统针对动 物待敲除基因的gRNA革El点序列，设计相应的启动子，构建质粒，实现条件性基因敲除。
3. 权利要求2所述的快速构建方法在小鼠骨组织特异性Y谷氨酸羧化酶基因敲除小 鼠模型中的应用。
4. 一种小鼠骨组织特异性Y谷氨酸羧化酶基因敲除小鼠模型的快速构建方法，其特 征在于：设计CRISPR/Cas9系统针对小鼠GGCX基因的gRNA靶点序列，设计相应的启动子， 构建质粒，实现GGCX基因敲除；其中CRISPR/Cas9系统针对小鼠GGCX基因的gRNA靶点为 两个，其序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。
5. 根据权利要求4所述的快速构建方法，其特征在于：所述SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2分别是针对GGCX外显子一和外显子二的gRNA靶点。
6. 根据权利要求5所述的快速构建方法，其特征在于：所述启动子为小鼠骨特异性 Osterix启动子，序列如SEQ ID NO. 19所示。
7. 根据权利要求6所述的快速构建方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9系统中的 Cas9质粒，包括Cas9基因及核定位信号序列，含有如SEQ ID NO. 10所示的碱基序列。
8. 根据权利要求7所述的快速构建方法构建得到的用于条件性敲除小鼠GGCX基因的 质粒，其特征在于：为P〇sterix-Cas9-gRNAl-gRNA2,质粒图谱见附图7所示。
9. 权利要求8所述的质粒在快速构建骨特异性GGCX基因敲除小鼠模型中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种条件性基因敲除动物模型的快速构建方法，其是采用CRISPR/Cas9技术完成的。具体方法可以为：设计CRISPR/Cas9系统针对动物待敲除基因的gRNA靶点序列，设计相应的启动子，构建质粒，实现条件性基因敲除。其可以实现快速有效、简单易行、经济高效、适用范围广的条件性基因敲除动物模型的构建，可以解决上述传统方法(特异性重组酶系统Cre-LoxP)的缺陷。
【IPC分类】A01K67-027, C12N15-85
【公开号】CN104745626
【申请号】CN201410802935
【发明人】戴钟铨, 梁培龙, 曹宏卿, 吴峰, 杨超, 张洪玉, 李金桥, 陈键, 万玉民, 李莹辉
【申请人】中国航天员科研训练中心
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2014年12月19日