一种游动放线菌基因组规模代谢网络模型构建及分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种游动放线菌基因组规模代谢网络模型构建方法及分析方法，属于 系统生物学领域。
【背景技术】
[0002] II型糖尿病是一种世界性的疾病，目前全世界有320百万II型糖尿病患者，并且 患者人数在持续不断增加中。临床常用抗II型糖尿病药物主要有双胍类、磺酰脲类、a-葡 糖苷酶抑制剂、噻唑烷双酮类和绿茴苯酸类，阿卡波糖由于其作用温和持久性和无毒作用 的特点得到广泛应用。
[0003] 作为发酵生产阿卡波糖的常用菌株，游动放线菌应用广泛。1977年，德国Bayer 从土壤中筛得阿卡波糖工业生产菌Actinoplanessp.SE50(ATCC31042)。随后，工业生 产的菌种通过菌株选育和发酵优化得到不断的改善。Byoung通过诱变菌株Actinoplanes sp.SE50/110筛得菌株CKD485-16,发酵优化后阿卡波糖产量达到3200mg/L。WangYJ利用 离子注入诱变得到菌株Actinoplanessp.ZJB-08196,采用培养基优化、控制渗透压、添加 腺苷蛋氨酸和有效霉素A等技术手段，阿卡波糖的浓度达到6. 6g/L。张琴等通过紫外、NTG、 DES和亚硝酸诱变，筛得突变株SIPI-AK，发酵水平比出发菌株提高了 35 %，优化后阿卡波 糖产量达3130mg/L。随着糖尿病患者人数的不断增加，阿卡波糖需求量也在不断增加，但是 传统的发酵优化存在着一些问题：（1)传统的菌株选育和发酵优化盲目、耗时长而且似乎 达到了极限；（2)菌种Actinoplanes生产阿卡波糖过程中一些代谢机制不清楚，代谢瓶颈 未知。因此我们需要系统地了解微生物的生理代谢特性，并且为发酵条件优化提供一定的 基础。
[0004] 随着基因组测序技术的完善和菌株基因组序列的积累，生化数据库的建立，基因 组规模代谢网络模型（Genome-ScaleMetabolicModel)成为研宄的热点。常规的基因组 规模代谢网络模型构建是根据公布的基因组测序结果提取具有代谢功能的基因，再整合生 化数据库和文献信息，进而组合成代表目的微生物细胞内已知生化反应的反应列表，但是 此方法工作量大耗时长。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述问题，本发明提出一种半自动化的整合微生物基因组规模代谢网络 模型构建方法。运用此方法进行代谢网络模型构建的优点是更加省时、方便，且所得模型更 为全面、准确。同时，本发明提出了一种理性设计发酵优化的方法，具有结合微生物生理特 点，降低工作强度，减少盲目摸索等优点，为相关发酵产品的发酵条件优化提供一定的指导 作用。
[0006] 本发明的第一个目的是一种提高阿卡波糖产量的方法，所述方法是在游动放线菌 的发酵过程中，通过以下任意一种方式或者两种以上方式的结合来提高阿卡波糖产量：（1) 添加烟酸；（2)添加氨基酸；（3)控制pH为中性；(4)控制溶氧。
[0007] 所述氨基酸，在本发明的一种实施方式中为以下任意一种或者多种的组合：谷氨 酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺。
[0008] 所述烟酸，在本发明的一种实施方式中，其添加量为2mg/L_10mg/L。
[0009] 所述控制溶氧，在本发明的一种实施方式中是指控制通气速率0. 4vvm_l.Ovvm。
[0010] 所述氨基酸，在本发明的一种实施方式，其添加量为Ommol/L-2.Ommol/L。
[0011] 所述游动放线菌，在本发明的一种实施方式中为Actinoplanes sp.SE50/110(ATCC31044)。
[0012] 所述游动放线菌的发酵，在本发明的一种实施方式中，使用的培养基为全合成培 养基。
[0013] 所述游动放线菌的发酵，在本发明的一种实施方式中，发酵温度为26-30°C，当使 用摇瓶发酵（50mL/500mL)时转速为200rpm，当使用发酵罐发酵（4. 5L/7. 5L)时转速为 400rpm〇
[0014] 所述游动放线菌的发酵，在本发明的一种实施方式中，具体是：取对数生长中后 期的种子液，离心得到菌体并用生理盐水洗涤后重悬，最后以8-12% (V/V)的接种量接 种到含有全合成培养基的发酵罐中培养，培养温度为26-30°C。还可以在全合成培养基 中添加烟酸或者氨基酸以提高阿卡波糖的产量。还可以同时控制中性pH或者通气速率 0. 4vvm-l.Ovvm以促进阿卡波糖合成。结果显示，在上述条件下都可以提高阿卡波糖的产 量。
[0015] 所述提高阿卡波糖产量的方式，在本发明的一种实施方式中，是通过构建游动放 线菌基因组规模代谢网络模型并对模型进行分析而得到的；所述模型的构建是：根据公布 的目的微生物的基因组测序结果，采用多种基因组注释技术进行全基因注释，同时根据生 化数据库和文献数据进行补充，构建具有基因一蛋白质一反应关联关系的基因组规模代谢 网络模型，随后在Matlab平台上使用Cobra工具箱对模型进行模拟验证分析。
[0016] 本发明的第二个目的是提供一种游动放线菌基因组规模代谢网络模型的构建与 分析方法，所述方法包括：全基因组注释与初模型的构建、模型的精炼、数学模型的建立、模 型的验证与分析四个步骤。
[0017] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括：根据公布的目的微生物的基因组测 序结果，采用多种基因组注释技术进行全基因注释，同时根据生化数据库和文献数据进行 补充，构建具有基因一蛋白质一反应关联关系的基因组规模代谢网络模型，随后在Matlab 平台上使用Cobra工具箱对模型进行模拟验证分析、并对其提高阿卡波糖产量提供策略。
[0018] 所述目的微生物为Actinoplanessp.SE50/110,其构建的最终模型为iYLW1028。
[0019] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体包括：
[0020] (1)全基因组注释与初模型的构建：首先从NCBI数据库平台上下载最新的Fasta 格式的目的微生物基因组序列，然后采用全自动化的基因组注释方法和同源比对方法 (Blastp)，对目的微生物基因组序列注释进行整合，从而得到目的微生物的基因信息，得到 初始反应列表，构建出以基因一蛋白质一反应关联为核心的代谢网络初模型。
[0021](2)模型的精炼：模型精炼的主要目标是通过整合生化数据库和文献数据来修补 初模型不完善的方面并建立物种特异的详细反应列表，具体工作包括统一代谢物格式、删 除重复和不恰当反应、添加阿卡波糖合成反应、添加转运反应、填补代谢漏洞、平衡反应质 量电荷、确定亚细胞定位、建立生物量方程。
[0022] (3)数学模型的建立：将上述反应列表转换成数学模型，其核心内容是计量系数 矩阵，通常用S表示。在Matlab平台上安装COBRA工具箱，通过xls2model.m程序可将精 细代谢模型转换成系统生物学语言格式的文件（SBML)后可在计算机上模拟。
[0023] (4)模型的验证与分析：基于约束条件的模拟优化方法是基因组规模代谢网络模 型常用的模拟算法，其中最常用的是流量平衡分析（FluxBalanceAnalysis，FBA)。通过 Cobra工具箱的使用，模拟微生物在特定条件下的代谢状况，包括必需基因和必需反应分 析、模型的定性和定量验证分析，模型的定性和定量验证分析要和文献数据和实验数据进 行比较。
[0024] 所述同源比对，在本发明的一种实施方式中，是将Streptomyces coelicolor A3(2)和Bacillus megaterium WSH002的基因组序列与目的菌进行同源比对。
[0025] 所述补充信息来源于KEGG、Meta