一种无创检测egfr基因突变的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因诊断领域。更具体地，本发明涉及表皮生长因子受体（印idermal growthFactorRec印tor，EGFR)基因突变的检测方法。本发明还涉及用于EGFR基因突变 检测的试剂盒。
【背景技术】
[0002] EGFR即表皮生长因子受体，正常情况下包埋在细胞表面的细胞膜中。EGFR基因长 约118kb，包括28个外显子，其编码的是一种170KD的糖蛋白，由1186个氨基酸组成。其是 一种对肿瘤细胞的增殖、生长、修复和存活等起重要作用的膜蛋白。目前靶向治疗已经成为 非小细胞肺癌（NSCLC)临床治疗的重要手段。易瑞沙（Iressa/吉非替尼/Gefitinib，阿 斯利康）和特罗凯（Tarceva/厄罗替尼/Erlotinib，罗氏制药）作为表皮生长因子受体 (EGFR)酪氨酸激酶抑制剂（TKI)，是美国FDA批准用于NSCLC靶向治疗的主要药物。但是， 临床试验表明易瑞沙和特罗凯仅对10-30%的NSCLC病人有显著疗效。进一步的研究发现 EGFR基因突变与NSCLC靶向治疗的疗效具有相关性，绝大多数携带EGFR基因突变的病人疗 效显著。大量研究资料表明EGFR基因突变主要集中在酪氨酸激酶区（tyrosinekinase codingdomain, 18-21外显子），其中19外显子多为框内缺失（746-753)性突变，约占所有 突变的45% ;21外显子多为替代突变（主要是L858R)，约占所有突变的40%。目前普遍认 为，这两个热点突变可以增强肿瘤细胞对TKI的敏感性，并且可作为TKI治疗的有效预测指 标。因此，检测EGFR基因突变对于指导NSCLC病人临床用药具有重要的参考价值。目前临 床上使用的EGFR检测方法有：1)传统测序法。该方法的特点是准确性高。但是，传统测序 对样品来源要求高，测序时间长，需要对序列进行分析，费用高，限制了其在临床上的使用； 2)聚合酶链式反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP)方法。该方法是一种经典的基因突 变检测方法，可以对未知的突变进行检测。该方法操作简单，灵敏性高。但是其缺点也很明 显，即需要平行的标准对照。假阳性高，当检测小于200bp的PCR产物时，检出率为75-95 %， 当检测大于400bp的PCR样品时，检出率仅仅为50%左右。3)突变体富集PCR方法：这是 一种用限制性内切酶选择性消化野生型EGFR基因的两步PCR。在第一次PCR之后，选择性 消化野生型EGFR，从而使突变的EGFR基因得到富集，然后再进行第二次PCR，最后电泳检测 PCR产物，然后根据PCR产物的检测结果判定EGFR是否发生突变。该方法的灵敏性高，可以 从103-104个野生型的EGFR中检测到一个突变。但是缺点是需要两次PCR和酶切，过程复 杂，费时。另外还有AMRS方法和微数字PCR等技术，但是相关技术在临床上使用仍然需要 时间。
[0003] 因此，在临床上迫切需要一种快速，高效的检测EGFR基因突变的方法。本发明人 在研究片段DNA的检测时，发现了一种新的DNA片段的检测方法，即通过对DNA片段的环 化，然后对DNA片段进行扩增。在此基础上，结合第二代高通量测序技术，发明人特别根据 EGFR基因对该方法进行了改进，并特别根据EGFR设计了优选的引物，开发了一种通过血浆 DNA对EGFR基因的突变进行测序和分析的方法以及其试剂盒。
【发明内容】
[0004] 根据本发明的一个方面，提供了一种无创检测受试者中EGFR基因突变的方法，其 特征在于，包括以下步骤：
[0005] 针对EGFR基因外显子设计引物；
[0006] 抽提受试者血浆DNA;
[0007] 将上述抽提的血浆DNA与标签接头连接；
[0008] 将上述与标签接头连接的血浆DNA进行PCR预扩增；
[0009] 将所述扩增后的DNA进行环化，得到环化DNA;
[0010] 利用所述引物对所述环化DNA进行PCR扩增；以及
[0011] 对所述PCR扩增的产物进行高通量测序并分析EGFR基因的突变。
[0012] 进一步地，所述引物是一对相邻且背向延伸的引物对。
[0013] 进一步地，所述背向延伸的引物对中的引物均位于所述EGFR基因外显子的5'端 或3'端。
[0014] 进一步地，所述背向延伸的引物对之间间隔所述片断DNA总碱基对的0-1 / 2。
[0015] 进一步地，所述背向延伸的引物针对EGFR基因外显子18、外显子19、外显子20、外 显子21。
[0016] 进一步地，所述背向延伸的引物5'端含有用于高通量测序文库的接头序列。
[0017] 进一步地，所述背向延伸的引物针对EGFR基因外显子18、外显子19、外显子20或 外显子21，其引物序列分别为：
[0018] E18-1-3F：CCCAGCTTGTGGAGCCTC
[0019] E18-1-3R：GACAAGAACACAGAGACAAGGGT
[0020] E18-2-F：GCAGGGCCTCTCATGGTC
[0021] E18-2-R：CCTGTGCCAGGGACCTTAC
[0022] E19-1-F：ACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCAT
[0023] E19-1-R：GTGAGATGGTGCCACATGCT
[0024] E19-2-F：GTCCATGGCTCTGAACCTCA
[0025] E19-2-R：CCACACAGCAAAGCAGAAAC
[0026] E20-1-F：CACACTGACGTGCCTCTCC
[0027] E20-1-R：CTTCGCATGGTGGCCAGA
[0028] E20-2-1F：CCTCCCCGTATCTCCCT
[0029] E20-2-1R：GGAGATAAGGAGCCAGGAT
[0030] E21-1-F：AGCAGGGTCTTCTCTGTTTCA
[0031] E21-1-R：GAGGGACAGATCATCATGGG
[0032] E21-2-F：TTTCCTGACACCAGGGACC
[0033] E21-2-R：TGACCTAAAGCCACCTCCTT〇
[0034] 进一步地，所述环化采用的是夹板介导的单链DNA环化。
[0035] 进一步地，所述血浆DNA的EGFR基因具有插入、缺失、替换或基因融合突变。
[0036] 进一步地，其中所述的高通量测序方法选自所述高通量测序技术选自Roche/ 454FLX>Illumina/Hiseq/Miseq>AppliedBiosystemsSOLID和lifeTechnologies/IonTorrent/Proton。
[0037] 根据本发明的另外一个方面，提供了一种无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特 征在于，包括：血浆DNA提取试剂、DNA环化酶、目标DNA扩增引物及扩增试剂。
[0038] 进一步地，包括：EGFR基因待检测区域预扩增引物及预扩增试剂。
[0039] 进一步地，包括用于高通量测序的试剂。
[0040] 进一步地，其中所述的用于高通量测序的试剂是用于如下高通量测序技术的： Roche/ 454FLX、Illumina/Hiseq/Miseq、AppliedBiosystemsSOLID和life Technologies/IonTorrent/Proton。
[0041] 进一步地，所述EGFR基因待检测区域扩增引物是一对相邻且背向延伸的引物对。
[0042] 进一步地，所述背向延伸的引物对中的引物均位于所述EGFR基因的待检位点或 待检区域的5'端或3'端。
[0043] 进一步地，所述背向延伸的引物对之间间隔所述血浆DNA总碱基对的0-1 / 2。
[0044] 进一步地，所述背向延伸的引物针对EGFR基因外显子18、外显子19、外显子20、外 显子21。
[0045] 进一步地，所述背向延伸的引物针对EGFR基因外显子18、外显子19、外显子20或 外显子21，其引物序列分别为：
[0046]E18-1-3F：CCCAGCTTGTGGAGCCTC
[0047] E18-1-3R：GACAAGAACACAGAGACAAGGGT
[0048]E18-2-F：GCAGGGCCTCTCATGGTC
[0049] E18-2-R：CCTGTGCCAGGGACCTTAC
[0050] E19-1-F：ACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCAT
[0051]E19-1-R：GTGAGATGGTGCCACATGCT
[0052]E19-2-F：GTCCATGGCTCTGAACCTCA
[0053] E19-2-R ：CCACACAGCAAAGCAGAAAC
[0054]E20-1-F：CACACTGACGTGCCTCTCC
[0055]E20-1-R：CTTCGCATGGTGGCCAGA
[0056]E20-2-1F：CCTCCCCGTATCTCCCT
[0057]E20-2-1R：GGAGATAAGGAGCCAGGAT
[0058]E21-1-F：AGCAGGGTCTTCTCTGTTTCA
[0059]E21-1-R：GAGGGACAGATCATCATGGG
[0060]E21-2-F：TTTCCTGACACCAGGGACC
[0061]E21-2-R ：TGACCTAAAGCCACCTCCTT〇
[0062] 进一步地，所述血楽DNA连接接头带有标签序列。
[0063] 进一步地，在对所述血浆DNA进行环化之前，进一步包括对所述血浆DNA进行预扩 增的步骤。
[0064] 进一步地，所述环化采用的是夹板介导的单链DNA环化。
[0065] 进一步地，所述EGFR基因的待检测位点或待检区域具有插入、缺失、替换或基因 融合突变。
[0066] 根据本发明的再一个方面，提供了针对EGFR基因外显子的引物在制备用于无创 检测受试者中EGFR基因突变的诊断试剂或试剂盒中的用途，其特征在于，所述诊断试剂或 试剂盒适用于包括以下步骤的无创检测受试者中EGFR基因突变的方法：
[0067] 抽提受试者血浆DNA;
[0068] 将上述抽提的血浆DNA与标签接头连接；
[0069] 将上述与标签接头连接的血浆DNA进行PCR预扩增；
[0070] 将所述扩增后的DNA进行环化，得到环化DNA;
[0071] 利用所述引物对所述环化DNA进行PCR扩增；以及
[0072] 对所述PCR扩增的产物进行高通量测序并分析EGFR基因的突变。
[0073] 进一步地，所述引物是一对相邻且背向延伸的引物对。
[0074] 进一步地，所述背向延伸的引物对中的引物均位于所述EGFR基因外显子的5,端 或3'端。
[0075] 进一步地，所述背向延伸的引物对之间间隔所述片断DNA总碱基对的0-1 / 2。
[0076] 进一步地，所述背向延伸的引物针对EGFR基因外显子18、外显子19、外显子20、外 显子21。
[0077] 进一步地，所述背向延伸的引物5'含有用于高通量测序文库的接头序列。
[0078] 进一步地，所述背向延伸的引物针对EGFR基因外显子18、外显子19、外显子20或 外显子21，其引物序列分别为：
[0079] E18-1-3F：CCCAGCTTGTGGAGCCTC
[0080] E18-1-3R：GACAAGAACACAGAGACAAGGGT
[0081] E18-2-F：GCAGGGCCTCTCATGGTC
[0082] E18-2-R：CCTGTGCCAGGGACCTTAC
[0083] E19-1-F：ACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCAT
[0084] E19-1-R：GTGAGATGGTGCCACATGCT
[0085] E19-2-F：GTCCATGGCTCTGAACCTCA
[0086] E19-2-R：CC