精神分裂症生物标记物、检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及精神分裂症生物标记物、检测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 精神分裂症病是最严重、最复杂的神经精神疾病之一，全世界终生患病率约为 1%，其临床症状主要有幻觉、妄想、神经生理功能障碍和神经认知功能障碍等。长期以来， 精神分裂症缺乏特异性病理诊断指标，诊断延迟或误诊对疾病的预后非常不利。因此，寻找 一种具有高度稳定性、特异性和敏感性的生物标记物已成为精神分裂症研究的重要方向。 另外，目前精神分裂症的药物治疗主要涉及多巴胺受体系统，5-HT受体系统和氨基丁 酸能系统，但药理作用机制并不明确，治疗缺乏针对性和预测性。大量研究显示miRNA在调 节神经结构和功能的诸多方面具有重要作用，但目前尚未确定哪些miRNA在精神分裂症的 病理机制中扮演重要作用，而且，绝大多数精神分裂症患者被确诊后都需要进行抗精神病 药物治疗，而药物治疗对miRNA表达水平的影响也并不清楚。仅有的相关研究只限于以大 鼠为研究对象，并且研究结论相互矛盾。在详细查阅国内外文献的基础上发现，国内未见相 关研究报道，国外研究中罕有以汉族人群为研究对象的相关研究，并且，目前尚无以人体为 研究对象的关于抗精神药物对精神分裂症患者miRNA表达水平影响的系统研究。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是：提供一种精神分裂症诊断生物标记物。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：精神分裂症诊断生物标记物， 所述标记物包括miRNA-30e、miRNA-181b、miRNA-346、miRNA-34a和miRNA-7。
[0005] 在本发明的第二方面，提供了上述精神分裂症诊断生物标记物的检测方法，包括 以下步骤：取适量受试者血液，从血浆中提取总RNA，并加入线虫合成miR-39作为外参进 行正太化校正后进行逆转录反应；反应完成后进行实时荧光定量PCR，得到miRNA-30e、 miRNA-181b、miRNA-346、miRNA-34a和miRNA-7 的含量，以miRNA与外参miR-39 之间阈值环 (thresholdcycle,Ct)之差计算ACt值，以2-ACt表示miRNA的相对表达水平，将得到 的数据与标准值进行双侧显著性检验，所述标准值可以来源于同批次检测的健康人血液样 本得到的数据，也可以通过建立miRNA-30e、miRNA-181b、miRNA-346、miRNA-34a和miRNA-7 的常模，得到的标准数值。
[0006] 在本发明的第三方面，提供了一种精神分裂症诊断试剂盒，其能够测定血液中 miRNA-30e、miRNA-181b、miRNA-346、miRNA-34a和miRNA-7 的含量。
[0007] 在本发明的第四方面，提供了一种精神分裂症转归生物标记物，所述标记物包括 miRNA-30e、miRNA-181b、miRNA-132 和miRNA-432。
[0008] 在本发明的第五方面，提供了上述精神分裂症转归生物标记物的检测方法，包 括以下步骤：取适量接受药物治疗后患者的血液，从血浆中提取总RNA，并加入线虫合成 miR-39作为外参进行正太化校正后进行逆转录反应；反应完成后进行实时荧光定量PCR， 得到miRNA-30e、miRNA-181b、miRNA-132 和miRNA-432 的含量，以miRNA与外参miR-39 之间 阈值环（thresholdcycle,Ct)之差计算ACt值，以2-ACt表示miRNA的相对表达水平， 将得到的数据与标准值进行双侧显著性检验，所述标准值可以来源于同批次检测的健康人 血液样本得到的数据，也可以通过建立miRNA-30e、miRNA-181b、miRNA-132和miRNA-432的 常模，得到的标准数值。
[0009] 在本发明的第六方面，提供了一种精神分裂症转归检测试剂盒，其能够测定血液 中miRNA-30e、miRNA-181b、miRNA-132 和miRNA-432 的含量。
[0010] 本发明的有益效果在于：
[0011] 1、精神分裂症的诊断将不再只是主观经验判断，而是可以通过microRNA这种客 观指标检查，进行确诊，提高诊断准确率，简化诊断过程；
[0012] 2、有望通过miRNA模拟物和拮抗物（修饰寡核苷酸）改变特定miRNA表达水平能 够使异常的基因调控网络和信号通路正常化，进而治疗精神分裂症；
[0013] 3、有望通过检测特定miRNA表达水平对用药疗效进行预测；
[0014] 4、有望通过检测特定miRNA表达水平对精神分裂症患者转归及预后情况进行预 测；
[0015] 5、有望通过miRNA模拟物和拮抗物对特定精神分裂症某种特定症状进行针对性 治疗。
【附图说明】
[0016]图 1 为用药前病例组与对照组miRNA-30e、miRNA-181b、miRNA-346、miRNA-34a和 miRNA-7的表达水平比较。
[0017] 图 2 为miRNA-30e、miRNA-181b、miRNA-346、miRNA-34a和miRNA-7 的联合R0C曲 线图。
[0018]图 3 为病例组用药前后miRNA-30e、miRNA-181b、miRNA-132 和miRNA-432 的表达 水平（ACt)变化线图。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1精神分裂症诊断生物标记物
[0020] 1、研究对象
[0021] ①病例组：2012年7月至2013年5月于中国人民解放军第102医院（以下简称102 医院）门诊以及精神科连续收治病人。入组标准：符合美国精神疾病诊断和统计手册第4 版（DSM-IV)精神分裂症诊断标准；首发病人或入组前3个月未服抗精神病药物；年龄15~ 60岁。排除标准：患有其他精神疾病；患有脑外伤等躯体或神经系统疾病；有酗酒或药物滥 用史；入组前1个月内有输血史；入组前3个月内使用过无抽搐电休克治疗者（MECT)。
[0022] ②对照组：来自102医院工作人员、健康体检人员，除一例性别不匹配外，其余与 病例组年龄、性别和民族一一匹配，最大限度排除了性别、年龄和民族等因素带来的误差。 纳入标准：无精神分裂症家族史；近1个月内无重大创伤事件；近1月内无输血史。
[0023] 本研究获得102医院医学伦理委员会批准，所有受试者或受试家属（监护人）均 签署知情同意书。
[0024] 2、研究方法
[0025] ①使用量表：阳性与阴性症状量表（PANSS);大体评定量表（GAS);临床疗效总评 量表（CGI);
[0026] ②资料收集：入组时记录一般情况（姓名、性别、年龄、民族、文化程度、职业、收入 水平、婚姻状况、药物成瘾史及精神疾病家族史等）。由精神科主治医师使用阳性与阴性症 状量表（PANSS)、大体评定量表（GAS)和临床疗效总评量表（CGI)于用药前、用药3周及用 药6周对病例组被试的疾病严重程度和疗效进行评定，并记录相关临床信息（主要治疗药 物、药物剂量、不良反应、治疗疗程等）。同样，记录正常对照组一般情况。评定前，3名医师 进行统一培训，熟练掌握标准化施测程序。
[0027] ③药物干预：在25例患者中，7例服用奥氮平（初始剂量5mg，平均剂量13mg，剂量 范围5-20mg) ;8例服用奎硫平（初始剂量100mg，平均剂量550mg，剂量范围100-800mg); 6例服用齐拉西酮（初始剂量40mg，平均剂量135mg，剂量范围40-140mg)。4例服用利培酮 (初始剂量2mg，平均剂量4. 7mg，剂量范围2-6mg);
[0028] ④主要试剂和耗材：RNA提取试剂盒：miRNeasy血清/血浆提取试剂盒（