一种用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物、探针和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因 的引物、探针和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 碳青霉烯类抗生素抗菌谱广，抗菌活性强，杀菌作用快。碳青霉烯类抗生素一直 以来是治疗肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌感染最有效的抗生素。近年来碳青霉烯水解酶 的出现使得碳青霉烯类抗生素的耐药现象日趋严重，其中最典型的就是KPC(Klebsiella pneumoniae carbapenemases，肺炎克雷伯菌碳青霉稀酶）的产生是目前引起肠杆菌科细菌 对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。
[0003] 随着肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的感染率逐渐上升，临床上采用改良的Hodge实验 进行检测，但是该方法的假阳性率较高，而当肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶低水平表达时又会 产生假阴性。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶不准确的问题，本发明实施例提 供了一种用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物、探针和试剂盒。所述技术方案如 下：
[0005] -方面，本发明实施例提供了一种用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物 和探针，所述引物和探针包括：用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物、用于检 测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物和用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的 探针，其中，
[0006] 所述用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1 所示；
[0007] 所述用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2 所示；
[0008] 所述用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探针如序列表中SEQ ID NO. 3所 示；
[0009] 所述探针的5'端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、J0E、VIC、R0X、Cy3或Cy5,所述 探针的 3' 端连接有淬灭基团 TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
[0010] 另一方面，本发明实施例提供了一种用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的试 剂盒，所述试剂盒包括上述引物和探针。
[0011]具体地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控 品、阴性质控品和工作标准品。
[0012] 具体地，所述工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作 标准品4,其中，
[0013] 所述工作标准品1为IX 107拷贝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片 段；
[0014] 所述工作标准品2为IX 106拷贝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片 段；
[0015] 所述工作标准品3为IX 105拷贝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片 段；
[0016] 所述工作标准品4为IX 104拷贝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片 段。
[0017] 具体地，所述阳性质控品为1. OX 106拷贝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的 基因片段。
[0018] 具体地，所述正向引物和所述反向引物的终浓度均为0. 05-0. 9 yM，所述探针的终 浓度为 0.05-0. 9 yM。
[0019] 具体地，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/ y L~0. 05U/ y L的Taq酶、终浓度为0. 2~0. 6mM的dNTPs、10XPCR缓冲液和终浓度为 1. 5~5. OmM的含Mg离子的溶液。
[0020] 具体地，所述核酸释放剂包括无菌水、终浓度为0. 03-0. 3 %的聚乙二醇辛基苯基 醚、终浓度为0. 04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和pH值为8. 3的终浓度为0. 01-0. 1M 的三（羟甲基）氨基甲烷。
[0021] 具体地，所述临界阳性质控品为1. ox 104拷贝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯 酶的基因片段。
[0022] 具体地，所述阴性质控品为浓度0. 8%的生理盐水。
[0023] 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的用于检测 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物和探针，该引物和探针具有灵敏度高的特性，使得本 发明实施例提供的用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的试剂盒，也具有灵敏度高的特 性，该试剂盒采用仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，其检测结果可靠，提高了 检测的灵敏度，即使仅存在单拷贝的目的片段该试剂盒也可以进行有效的检测。
【附图说明】
[0024] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他 的附图。
[0025] 图1是本发明实施例2提供的荧光扩增曲线图；
[0026] 图2是本发明实施例3提供的荧光扩增曲线图；
[0027] 图3是本发明实施例4提供的荧光扩增曲线图；
[0028] 图4是本发明实施例5提供的标准曲线的荧光扩增曲线图；
[0029] 图5是本发明实施例5提供的荧光扩增曲线图；
[0030] 图6是本发明实施例5提供的由图4得到的标准曲线图，图6横坐标为 LogStarting Quantity copy number，纵坐标为 Threshold Cycle。
[0031] 图中：Cycles 为循环数，RFU为焚光值，Log Starting Quantity copy number为肺 炎克雷伯菌碳青霉稀酶基因起始浓度的对数值，Ct (Threshold Cycle)值为循环数；la-实 施例2中样品1，4a-实施例2中样品4，5a-实施例2中样品5，6a-实施例2中样品6，7a-实 施例2中样品7。
【具体实施方式】
[0032] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方 式作进一步地详细描述。以下实施例中所用试剂和探针主要购自宝生物工程（大连）有限 公司。
[0033] 实施例1. 一种用于肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因核酸定量检测的引物和探针 [0034] 本发明实施例提供了一种用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物和探针， 该引物和探针包括：用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物、用于检测肺炎克 雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物和用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探针，其 中，
[0035] 用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所 示；
[0036] 用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物如序列表中SEQ ID N0. 2所 示；
[0037] 用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探针如序列表中SEQ ID N0. 3所示；
[0038] 探针的5'端连接有荧光基团？411、册乂、了￡1\1(^、￥1(：、1?(?、〇73或〇75，探针的3' 端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQl、BHQ2、BHQ3或DABCYL。在本发明实施例中，探针 的荧光报告基团为FAM，FAM的激发波长为485nm，接收波长为527nm ;淬灭基团为Eclipse。 纯化方式可选自：HAP、PAGE和HPLC纯化方式，具体地引物和探针如下表：
[0039] 表1.肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物和探针
【主权项】
1. 一种用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物和探针，其特征在于，所述引物 和探针包括：用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物、用于检测肺炎克雷伯菌 碳青霉烯酶基因的反向引物和用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探针，其中， 所述用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所 示； 所述用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所 示； 所述用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探针如序列表中SEQ ID NO. 3所示； 所述探针的5'端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5,所述探针 的 3' 端连接有淬灭基团 TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
2. -种用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包 括如权利要求1所述的引物和探针。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反 应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括：工作标准品1、工 作标准品2、工作标准品3和工作标准品4,其中， 所述工作标准品1为IX IO7拷贝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段； 所述工作标准品2为I X IO6拷贝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段； 所述工作标准品3为I X IO5拷贝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段； 所述工作标准品4为I X IO4拷贝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段。
5. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为1.0 X 10 6拷贝/mL 的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段。
6. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述正向引物和所述反向引物的终浓 度均为0. 05-0. 9 y M，所述探针的终浓度为0. 05-0. 9 y M。
7. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应 体系中包括：终浓度为0.0 lU/ y L~0. 05U/ y L的Taq酶、终浓度为0. 2~0. 6mM的dNTPs、 10XPCR缓冲液和终浓度为1. 5~5. OmM的含Mg离子的溶液。
8. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂包括无菌水、终浓度为 0.03-0. 3%的聚乙二醇辛基苯基醚、终浓度为0.04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和pH 值为8. 3的终浓度为0? 01-0.1 M的三（羟甲基）氨基甲烷。
9. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述临界阳性质控品为1.0 X 10 4拷贝 AiL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段。
10. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为浓度0. 8%的生理 盐水。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物、探针和试剂盒，属于生物技术领域。所述引物和探针包括：用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物、用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物和用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探针。所述试剂盒包括上述的引物和探针。所述引物、探针和试剂盒具有灵敏度高的特性，能够快速检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68, C12R1-22
【公开号】CN104745690
【申请号】CN201510052461
【发明人】刘茹, 桑筱筱
【申请人】湖北永邦医疗科技有限公司
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年1月30日